Ghrelin 对脂肪间充质干细胞神经分化的影响

杨贺然, 李兴江, 胡嘉航, 李彦伟

（1. 牡丹江医学院附属红旗医院检验科, 黑龙江 牡丹江 157000；2. 牡丹江医学院解剖教研室, 黑龙江 牡丹江 157000；3. 牡丹江医学院附属红旗医院影像科, 黑龙江 牡丹江 157000）

神经损伤会造成机体运动和感觉功能受损, 严重影响人们的正常生活, 目前自体神经移植是最有效的治疗方法, 但存在供区损伤、手术时间长及费用较高等缺点[1］。脂肪间充质干细胞（adiposederived mesenchymal stem cells, ADSCs） 具 有 多向分化潜能, 不仅具有自体移植可行性, 还可通过分泌细胞因子或神经营养因子来促进内源性细胞的存活, 通过抑制炎症反应来促进组织修复, 已被发现在神经系统疾病中具有潜在治疗作用[2-4］, 因此有效促进ADSCs 神经向分化, 对神经损伤的治疗十分重要, 有必要对其机制进行深入探讨。Ghrelin作为一种具有调控营养、发育和神经保护作用的脑肠肽[5］, 被发现可促进ADSCs 神经分化, 但其详细的作用机制研究[6］较少。研究[7］证实：磷酸酰肌 醇 3 激 酶 （phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B, Akt）激活可促进脐带间充质干细胞神经分化, 具有神经保护作用, 但其在ADSCs 神经分化中的作用尚未见报道。Ghrelin 能够激活脂多糖诱导的胰岛β 细胞中PI3K/Akt 通路, 以此减轻细胞损伤[8］。因此本文作者通过研究Ghrelin 联合PI3K/Akt 通路特异抑制剂LY294002 对ADSCs 神 经 分 化 的 影 响, 为Ghrelin 在ADSCs 神经分化中的机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器H-DMEM 培养基（北京伊塔生物科技有限公司）, MTT 试剂盒（上海易汇生物科技有限公司）, PI3K/Akt 通路特异抑制剂LY294002（北京德航五洲科技有限公司）。Ghrelin（美国Sigma-Aldrich 公司）, 兔抗PI3K、Akt、磷酸化PI3K （phosphorylated PI3K, p-PI3K）、磷酸化Akt （phosphorylated Akt, p-Akt） 和β-actin 抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）, 兔抗神经元特异性烯醇化酶（2-phospho-D-glycerate hydrolase, NSE）和巢蛋白（Nestin）抗体（德国MilliporeSigma 公司）, 兔抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP） 抗体（丹麦Dako 公司）, 羊抗兔IgG-HRP 和羊抗兔IgG-FITC（美 国Abcam 公 司）, CD90-FITC 和CD106-PE（美国BioLegend 公司）, CD34-PE、CD13-PE 和CD45-FITC（美国BD Biosciences 公司）, 蛋白提取试剂盒（广州晨学生物科技有限公司）, BCA 蛋白定量试剂盒（上海李记生物科技有限公司）。流式细胞仪购自上海然哲仪器设备有限公司, CKX53ipc 三目倒置相差显微镜和Olympus BX63 自动荧光显微镜购自日本Olympus 公司, Omega Fluor 凝胶成像系统购自四川环亚生物科技有限公司。

1.2 人ADSCs 分离和培养将通过吸脂手术所获取的人ADSCs（25 mL）采用PBS 缓冲液冲洗后, 采用眼科剪剪成体积为1～2 mm3的小块, 除去结缔组织和血管, 添加等体积Ⅰ型胶原蛋白酶（0.1%）后于37 ℃水浴槽中消化1 h, H-DMEM 培养基（含15% 胎牛血清）终止消化, 1 500 r·min-1离心10 min, 弃上清, 将细胞密度调整为2×106cm-1后, 接种于培养瓶中培养（5% CO2、37 ℃）, 每隔48 h 更换培养液, 直至培养到细胞融合度约达80%时进行传代, 更换为含15%新生牛血清的H-DMEM 培养基培养, 培养至第4 代进行后续实验, 采用倒置相差显微镜观察细胞形态表现。

1.3 流式细胞术鉴定ADSCs 表面抗体阳性表达率将100 μL 第4 代ADSCs （每毫升2×106个）悬液加入至流式管中, 分别加入5 μ L 抗人CD90-FITC、CD34-PE、CD13-PE、CD106-PE 和CD45-FITC 单抗及其同型对照试剂避光孵育30 min, 采用流式细胞术检测表面抗体阳性表达率。

1.4 各组ADSCs 向神经分化后的形态表现将第4 代ADSCs 分 为 对 照 组、 LY294002 组（给 予40 μmol·L-1PI3K/Akt 通 路 特 异 抑 制 剂LY294002）[9］、 Ghrelin 组（给 予0.1 μmol·L-1Ghrelin）[10］和 Ghrelin+LY294002 组 （给 予40 μmol·L-1LY294002+0.1 μmol·L-1Ghrelin）。按照每孔4×103个ADSCs 的密度接种至预先放置于经多聚赖氨酸处理的无菌载玻片的24 孔细胞培养板中, 培养24 h 后弃培养液, 在对照组、LY294002 组、Ghrelin 组 和Ghrelin+LY294002 组ADSCs 中均加入含15%新生牛血清、10 μg·L-1碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF） 和20 μg·L-1表 皮 细 胞 生 长 因 子（epidermal growth factor, EGF）、20 μg·L-1脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF） 的H-DMEM 诱导培养基, 培养14 d, 倒置相差显微镜下观察第3、7、10 和14 天细胞形态表现。

1.5 免疫荧光染色法检测ADSCs 中NSE、Nestin和GFAP 阳性细胞百分率培养14 d 后, 弃去培养液, PBS 缓冲液洗涤后加入含4%多聚甲醛的PBS缓冲液过夜, 加入兔抗人NSE（1∶100）、Nestin（1∶200） 和GFAP （1∶100） 抗 体 后 过 夜 孵 育（4 ℃）, 室温下加入FITC 标记的羊抗兔二抗（1∶70）孵育1 h, Hoechst33258 染色5 min 后冲洗, 封片, 荧光显微镜观察拍照, 采用Image-Pro Plus 6.0 软件计算NSE、Nestin 和GFAP 阳性细胞百分率, 阳性细胞百分率＝阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.6 Western blotting 法检测ADSCs 中PI3K/Akt信号通路蛋白表达水平采用RIPA 裂解液将各组ADSCs 裂 解 后, 12 000 r·min-1离 心10 min 后 取 上清, 采用BCA 法检测ADSCs 中总蛋白浓度；每孔吸取30 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE 凝胶电泳, 分离蛋白, 根据蛋白相对分子质量大小进行切胶, 并转至PVDF 膜上, 脱脂奶粉封闭1 h 后添加一抗（兔抗PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt 和β-actin 抗体, 1∶1 000）, 4 ℃过夜孵育, 孵育2 h 后加入HRP 标记的IgG 二抗（1∶5 000）, ECL 化学发光试剂显影, 并置于蛋白凝胶成像仪中观察, 采用Image J软件分析各组ADSCs 中PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt 和β-actin 条带灰度值, 目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值, 并计算p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 比 值。

1.7 统计学分析SPSS 21.0 统计软件进行统计学分析。各组ADSCs 中NSE、Nestin 和GFAP 阳性细 胞 百 分 率, 各 组ADSCs 中PI3K、Akt、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平满足正态分布及方差齐性, 以±s表示, 多组间样本均数比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 第1 和4 代ADSCs 形态表现第1 代ADSCs呈长梭形或多角形, 第4 代ADSCs 形态均一, 均呈现长梭形。见图1。

图1 倒置相差显微镜观察ADSCs 形态表现（×100）Fig. 1 Morphology of ADSCs observerd by inverted phase contrast microscope (×100)

2.2 流式细胞术鉴定ADSCs 表面抗体阳性表达率流式细胞术检测结果显示：CD90（99.70%）和CD13（95.30%）呈高水平表达状态, 而CD34（0.20%）、CD45 （2.20%） 和CD106 （0.10%）均呈低水平表达状态。见图2。

图2 流式细胞术鉴定ADSCs 表面抗体阳性表达率Fig.2 Positive expression rates of surface antibodies of ADSCs identified by flow cytometry

2.3 各组ADSCs 形态表现观察诱导后第3、7、10 和14 天ADSCs 形态表现, 结果显示：第3 天时对照组ADSCs 胞体出现突起, 第7 天时胞体明显收缩, 第14 天时多数细胞由长梭形转变为类圆形胞体, 突起增长、数量增加；与对照组比较, LY294002 组仅部分细胞由长梭形转变为类圆形胞体, 突起较短、数量减少, 而Ghrelin 组细胞由长梭形转变为类圆形胞体速度增快；与LY294002 组比较, Ghrelin+ LY294002 组细胞由长梭形转变为类圆形胞体速度增快, 且突起数量增加。见图3。

图3 诱导不同时间后倒置相差显微镜下观察各组ADSCs 形态表现（×100）Fig.3 Morphology of ADSCs in various groups at different time after induction observed under inverted phase contrast microscope(×100)

2.4 各 组ADSCs 中NSE、Nestin 和GFAP 阳 性 细胞百分率与对照组比较, LY294002 组ADSCs 中NSE 和Nestin阳性细胞百分率降低（t=10.137,t=5.991,P＜0.05）, Ghrelin 组ADSCs 中NSE 和Nestin 阳性细胞百分率明显升高（t=8.485,t=4.855,P＜0.05）；与LY294002 组比较, Ghrelin+LY294002 组ADSCs 中NSE 和Nestin 阳 性 细 胞 百分率升高（t=10.093,t=6.798,P＜0.05）；各组ADSCs 中GFAP 阳性细胞百分率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1 和图4。

图4 各组ADSCs 分化形态表现（免疫荧光, ×200）Fig.4 Morphology of differentiation of ADSCs in various groups（Immunofluorescence, ×200）

表1 各组ADSCs 中NSE、Nestin 和GFAP 阳性细胞百分率Tab. 1 Percentages of NSE, Nestin, and GFAP positive cells in ADSCs in various groups (n=5, ±s, η/%）

表1 各组ADSCs 中NSE、Nestin 和GFAP 阳性细胞百分率Tab. 1 Percentages of NSE, Nestin, and GFAP positive cells in ADSCs in various groups (n=5, ±s, η/%）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with LY294002 group.

GFAP 7.26±1.03 7.07±1.51 7.68±1.62 7.50±1.74 Group Control LY294002 Ghrelin Ghrelin+LY294002 NSE 28.76±2.83 12.51±2.20*49.35±4.63*30.30±3.27△Nestin 15.59±2.48 7.22±1.90*25.37±3.76*16.79±2.51△

2.5 各组ADSCs 中p-PI3K、PI3K、p-Akt 和Akt 蛋白表达和p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 比值各组ADSCs 中p-PI3K、PI3K、p-Akt 和Akt 蛋白表达情况见图5。与对照组比较, LY294002 组ADSCs 中p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 比 值 降 低（t=5.292,t=5.188,P＜0.05）, Ghrelin 组ADSCs 中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt 比值升高（t=3.823,t=3.778,P＜0.05）； 与 LY294002 组 比 较, Ghrelin+LY294002 组ADSCs 中p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt比 值 升 高 （t=5.747,t=7.453,P＜0.05）, 见表2。

表2 各组ADSCs 中p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 比值Tab. 2 Ratios of p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt in ADSCs in various groups (n=5, ±s）

表2 各组ADSCs 中p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 比值Tab. 2 Ratios of p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt in ADSCs in various groups (n=5, ±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with LY294002 group.

p-Akt/Akt 1.30±0.20 0.72±0.15*1.79±0.21*1.34±0.11△Group Control LY294002 Ghrelin Ghrelin+LY294002 p-PI3K/PI3K 1.21±0.18 0.64±0.16*1.67±0.20*1.24±0.17△

图5 各组ADSCs 中PI3K/Akt 通路相关蛋白表达电泳图Fig. 5 Electrophoregram of expressions of PI3K/Akt pathway-related proteins in ADSCs in various groups

3 讨 论

神经系统损伤会严重影响患者正常生活, 目前最有效的治疗手段是自体神经移植, 但该治疗仍无法完全恢复受损的神经组织, 并且还会引发感觉缺失和疼痛性神经瘤等供区损伤[1］, 需要寻找新的方法促使神经系统再生[11］。ADSCs 是一种具有多向分化潜能的间充质干细胞, 其能够通过定向分化为神经细胞来治疗脊髓损伤、帕金森病和脑卒中等神经系统疾病[12-13］。因此促进ADSCs 神经向分化对神经损伤的治疗具有重要意义。本研究从人脂肪组织中分离出ADSCs, 并经细胞表面抗体检测发现：CD90 与CD13 呈高表达状态, 而CD34、CD45 和CD106 均呈低表达状态, 表明实验成功分离出ADSCs, 并进行后续实验。

Ghrelin 是一种从大鼠胃中所分离出的脑肠肽, 能够刺激垂体释放生长激素, 近年来, 有研究[14］显示：Ghrelin 泛分布于下丘脑、大脑皮层、海马和脊髓等神经组织中, 在神经系统的多种功能中具有重要作用。研究[6,15］显示：Ghrelin 能够促进神经再生, 促进海马神经元恢复及突触形成。Ghrelin已被证明具有神经保护作用, 能够增加神经元活力、抑制氧化应激及免疫反应、促进神经细胞增殖与分化。研究[16］显示：其可能通过激活β-连环蛋白（β-catenin）信号通路促进ADSCs 的神经分化。本研究所分离的ADSCs 在诱导神经发生后转变为类圆形胞体, 并延伸出突触, 并表达神经细胞特异性蛋白NSE 和Nestin, 与前人研究[16］结果一致。本研究结果显示：与对照组比较, Ghrelin 能够有效加快ADSCs 由长梭形转变为类圆形胞体及增加突起数, 还可促进细胞中NSE 和Nestin 表达, 而对细胞中星形胶质细胞活化标志物GFAP 表达无明显影响, 表明Ghrelin 可以显著促进ADSCs 神经分化。

PI3K 是神经营养因子介导的神经生长因子（nerve growth factor, NGF） 依 赖 性 神 经 细 胞 株PC12 细胞存活反应的调节剂, PI3K 下游因子Akt可在受到激活后产生NGF 和BDNF 等营养因子来改善神经干细胞向神经元的分化及存活[17］。PI3K/Akt 通路是调控神经分化所必需的信号通路, 具有神 经 保 护 作 用[18-19］。研 究[20］显 示：Achaete-scute同源物1 可通过激活PI3K/Akt 信号通路正调节神经祖细胞的神经元分化。5-氮杂胞苷能够诱导人ADSCs 定向分化为心肌细胞, 这可能与其激活PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR） 通 路 有 关[21］。本 研 究 采 用PI3K/Akt 通路特异性抑制剂LY294002 处理细胞发现：LY294002 能够抑制ADSCs 由长梭形向类圆形胞体的转变及减少突起数量, 还可抑制细胞中NSE 和Nestin 表达, 而对细胞中星形胶质细胞活化标志物GFAP 表达无明显影响, 表明抑制PI3K/Akt 通路会抑制ADSCs 神经向分化。研究[14］显示：Ghrelin 能够通过激活PI3K/Akt 通路来促进糖原合酶激酶3β 磷酸化, 促进运动神经元存活和再生, 以此发挥神经保护作用。本研究结果显示：与LY294002 组 比 较, Ghrelin+ LY294002 组ADSCs转变速度加快, 细胞中NSE 和Nestin 表达水平及p-PI3K/PI3K 比值和p-Akt/Akt 比值升高, 表明Ghrelin 能够逆转LY294002 对ADSCs 分化的抑制作用, Ghrelin 可能通过激活PI3K/Akt 通路来促进ADSCs 的神经分化。

综上所述, Ghrelin 可能通过激活PI3K/Akt 通路来促进ADSCs 神经分化。本研究不仅为阐明Ghrelin 在ADSCs 神经分化中的作用机制有重要帮助, 还对神经损伤疾病治疗机制的研究具有一定参考意义, 但本研究尚缺乏关于Ghrelin 对PI3K/Akt通路下游细胞因子影响机制的研究, 因此还需在未来进行深入探讨。