超声波辅助酶法提取香蕉皮多酚*

黄敏 张帅* 林诗堃 张天桦 朱丽萍

（肇庆学院食品与制药工程学院，广东肇庆 526000）

香蕉皮是香蕉加工产业中的主要副产物，约占香蕉总质量的30%。目前，香蕉皮除少数被用于动物饲料生产外，大多被废弃。香蕉皮中除含有大量果胶、低聚糖、纤维素、半纤维素、木质素等膳食纤维外，还富含多酚物质。多酚是广泛存在于植物体内的多元酚类化合物，具有抗癌、抗菌、抗氧化和预防心脑血管疾病等多种生理活性。随着香蕉深加工产业的发展，对香蕉皮开展综合利用研究，不仅能减轻环境污染，还可以创造经济效益，带动产业链发展。

利用超声波产生的机械效应和空化效应能有效破坏植物细胞壁、加速胞内成分溶出，而且超声波可使介质温度瞬间升高，避免有效成分被破坏。目前将超声波和纤维素酶联合用于黄酮提取的研究较多，而用于香蕉皮多酚的提取研究则未见报道。本研究先采用超声波辅助纤维素酶法提取香蕉皮多酚，然后设计均匀试验优化提取工艺，并对香蕉皮多酚的抑菌作用进行了测定。本研究可为进一步挖掘香蕉皮利用价值以及开发香蕉皮多酚类产品提供技术依据和数据参考。

1 材料与方法

1.1 原料试剂

香蕉，购于本地超市，新鲜无腐烂，取皮备用；纤维素酶，食品级，酶活力3 万IU/g，北京鸿润宝顺科技有限公司；没食子酸、福林酚试剂、乙醇、碳酸钠、柠檬酸、磷酸氢二钠等药品试剂，均为国产分析纯。

大肠杆菌（E.Coli）、金黄色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢杆菌（B.s），本院食品微生物实验室4 °C保存。

柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液：柠檬酸4.80 g，溶解后定容至250 mL（A 液，0.1 mol/L）；磷酸氢二钠7.10 g，溶解后定容至250 mL（B液，0.1 mol/L）。

纤维素酶缓冲液：吸取25 mL 0.1 mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶于50 mL 容量瓶，用蒸馏水将1.000 g纤维素酶溶解后移至50 mL容量瓶，定容。

1.2 仪器设备

UV/VIS 916 紫外可见分光光度计，GBC 科学仪器公司；PHS-3C 精密酸度计，上海大谱仪器有限公司；YXJ-2高速离心机、HH-6恒温水浴锅，金坛市环宇科学仪器厂；RE-2000 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；S-450D超声波细胞破碎仪（350 W，20 kHz），必能信超声有限公司；TDZ5-WS离心机，湖南省湘仪实验仪器开发有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 香蕉皮多酚提取

香蕉皮切片，沸水热烫5 min 以钝化多酚氧化酶活性。冷却后移至打浆机破碎，均质匀浆1 min后移至100 mL 烧杯中，加入乙醇，调pH 值，加入纤维素酶于水浴锅中浸提多酚，将其置于超声波细胞破碎仪中继续提取多酚，提取温度45 °C，提取液4 500 r/min 离心15 min，上清液即为香蕉皮多酚溶液。

1.3.2 香蕉皮多酚含量测定

采用福林酚法测定香蕉皮多酚含量。吸取3 mL香蕉皮多酚提取液，加入3 mL 福林酚试剂，混匀，3 min 内加入3 mL10%碳酸钠溶液，充分混匀，40 ℃水浴锅中避光放置1 h，在波长760 nm 处测吸光度。以试剂溶液作空白对照，分别将测得的吸光度值代入标准曲线方程得到样品液中多酚质量浓度，按下列公式计算香蕉皮（样品液）多酚得率（以干质量计）：M=C×（V×k）/m×103。式中：M为多酚得率，mg/g；C为提取液中多酚质量浓度（以没食子酸计），mg/mL；V为提取液体积，mL；m为香蕉皮质量，g；k为样液稀释倍数。

1.3.3 标准曲线建立

参考杨贤松等的方法，称取50 mg 没食子酸标准品，置于500 mL 容量瓶中溶解，振摇混匀后定容，即为0.1 mg/mL 没食子酸标准液；称取20 g 碳酸钠，加适量去离子水溶解，定容至200 mL，配制成10%碳酸钠溶液。分别吸取没食子酸标准溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL于100 mL容量瓶中，加入3 mL福林酚试剂，摇匀；放置3 min 后加入3 mL 10%碳酸钠溶液，摇匀；于40 °C 恒温槽中遮光反应1 h 后定容，各溶液没食子酸含量分别为0.0 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L、5.0 mg/L、6.0 mg/L、7.0 mg/L，于波长760 nm 处测吸光度，吸光度与没食子酸质量浓度之间的线性方程为：Y=0.114 3X+0.038 2，R2=0.991 9，该方程在1.0 mg/L～7.0 mg/L范围内呈良好线性关系。

1.4 试验设计

1.4.1 单因素试验

在超声时间20 min 条件下，分别考察乙醇体积分数、纤维素酶添加量、酶解时间、酶解pH 值、酶解时间5 个因素对多酚得率的影响，根据结果确定适宜的提取条件。

1.4.1.1 乙醇体积分数

配制不同乙醇体积分数（20%、30%、40%、50%、60%、70%）的香蕉皮匀浆液，将pH 值调至5，纤维素酶添加量0.02%，酶解温度45 °C，酶解时间1 h，考察乙醇体积分数对香蕉皮多酚得率的影响。

1.4.1.2 pH值

配制乙醇体积分数60%的香蕉皮匀浆液，分别调为不同pH 值（3、4、5、6、7、8），纤维素酶添加量0.02%，酶解温度45 °C，酶解时间1 h，考察pH值对香蕉皮多酚得率的影响。

1.4.1.3 酶添加量

配制乙醇体积分数60%的香蕉皮匀浆液，调pH 值为3，分别设定不同纤维素酶添加量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.06%、0.07%），酶解温度45 °C，酶解时间1 h，考察酶添加量对香蕉皮多酚得率的影响。

1.4.1.4 酶解温度

配制乙醇体积分数60%的香蕉皮匀浆液，调pH 值为3，纤维素酶添加量0.02%，分别设定不同酶解温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），酶解时间1 h，考察酶解温度对香蕉皮多酚得率的影响。

1.4.1.5 酶解时间

配制乙醇体积分数60%的香蕉皮匀浆液，调pH 值为3，纤维素酶添加量0.02%，酶解温度60 °C，分别设定不同酶解时间（60 min、80 min、100 min、120 min、140 min、160 min），考察酶解时间对香蕉皮多酚得率的影响。

1.4.2 均匀试验

以香蕉皮多酚得率为评价指标，设计均匀试验优化多酚提取工艺。根据单因素试验结果，用DPS 7.5软件设计5因素6水平U6（65）均匀试验。

1.4.3 香蕉皮多酚提取物抑菌性测定

先将E.Coli、S.a和B.s接种于牛肉膏琼脂培养基斜面上培养。采用滤纸片扩散法，将营养琼脂固体培养基溶化后倾入培养皿（20 mL/皿），待冷却凝固后加入0.2 mL 供试菌悬液，然后用无菌刮棒涂匀，吸取1 mL 香蕉皮多酚提取液于滤纸片（d=6 mm）上，并使其完全均匀分散，贴到涂抹适宜浓度菌悬液的培养基平板上，每皿2 片并以无菌水作对照，重复3 次。最后将供试菌株在37 ℃培养24 h后按十字交叉法测定清晰抑菌圈直径。

1.5 数据处理

每组试验做3次平行，用Excel 2010、Origin 8.0和DPS 7.5软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对香蕉皮多酚得率的影响

由图1 可知，香蕉皮多酚得率随乙醇体积分数增加而逐渐增大。当乙醇体积分数60%时，多酚得率最大；当乙醇体积分数大于60%时，多酚得率反而呈逐渐下降趋势。这主要是因为高浓度提取剂会引起细胞蛋白质变性，间接影响多酚溶出，最终导致得率降低。

图1 乙醇体积分数对多酚得率的影响

2.1.2 pH值对香蕉皮多酚得率的影响

由图2 可知，pH 值改变会影响酶活性从而影响多酚得率。当pH 值为3.0 时，多酚得率达到最大值1.924 mg/g。当pH值超过3.0时，得率反而下降，这可能与酶的最适酶解pH 值有关，当酶解pH 值偏离最适pH 值时不利于酶的催化作用，酶活性下降会减弱对细胞壁的破坏效果，不利于多酚的提取。

图2 pH值对多酚得率的影响

2.1.3 酶添加量对香蕉皮多酚得率的影响

由图3 可知，在0.01%～0.02%添加范围内，随着纤维素酶添加量的增加，多酚得率明显提高。当酶添加量为0.02% 时，多酚得率达到最大值2.201%。此后继续提高酶添加量，多酚得率反而降低。原因是当底物浓度一定时，增大酶量可以提高反应速度，从而提高得率；当酶浓度达到足以使反应迅速完成时，即为酶最大添加量，此时反应达到动态平衡；但当酶添加过多时，则会打破动态平衡而抑制反应使得率下降。

图3 酶添加对多酚得率的影响

2.1.4 酶解温度对香蕉皮多酚得率的影响

由图4 可知，随着酶解温度升高，香蕉皮多酚得率先升后降。当酶解温度为60 ℃时，多酚得率达到最大值1.9%。继续升温，会导致纤维素酶变性失活，酶解度下降多酚得率减小。

图4 酶解温度对多酚得率的影响

2.1.5 酶解时间对香蕉皮多酚得率的影响

由图5 可知，随着酶解时间的增加，香蕉皮多酚得率逐渐增加，当酶解时间为120 min 时，多酚得率最高为1.923%。超过120 min 后，多酚得率呈下降趋势，原因可能是时间过长导致纤维素酶活性降低或底物量不足导致反应终止。

图5 酶解时间对多酚得率的影响

2.2 均匀试验结果

均匀试验设计和结果如下页表1 所示。用DPS 7.5 数据处理系统对试验结果进行二次多项式逐步回归，建立回归方程，并对模型作显著性检验分析，结果见表2。

表1 均匀设计和结果

表2 二次多项式逐步回归分析结果

由DPS 7.5 软件分析得回归方程：Y=6.454 7-10.743 48X1+7.451 17X1X1-0.005 617 0X1X4+0.256 836X2X3。由表2可知，回归模型极显著（P=0.006 3<0.01），回归方程的决定系数R2=0.999 98，说明该方程可以解释99.998%的得率数据变异，方程拟合度非常好，可用于对试验结果的分析预测。由表2中的t检验值和P值分析可知，在试验范围内，各因素对得率影响最大的为乙醇体积分数（X1），达到极显著水平，其他单因素均不显著。各因素的交互项显著性表现为：X1X1、X1X4、X2X3的P值均达极显著水平。由各变量显著性P值可知对提取率影响的大小顺序为X1X4>X1>X1X1>X2X3。

方程求极值可得最优工艺参数，即最佳工艺条件为：乙醇体积分数45.0%，纤维素酶添加量0.06%，酶解pH值2.51，酶解时间108.42 min，酶解温度69.28 ℃，多酚得率最大预测值为2.893 7 mg/g。考虑到实际操作的方便性，将酶解pH 值、酶解时间及酶解温度3 个变量的工艺参数修饰为：2.5、108 min、70 ℃，在此工艺条件下重复试验3次，多酚得率平均为2.989 mg/g，相对误差为0.89%。

2.3 香蕉皮多酚提取物的抑菌性试验结果

如表3 所示，香蕉皮多酚提取物对3 种病原菌均表现出抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果较强，对大肠杆菌的抑菌作用较弱。由此推断，香蕉皮多酚提取物可能对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用。

表3 香蕉皮提取物对不同菌种的抑菌效果

3 结论

本研究采用超声波辅助纤维素酶法提取香蕉皮多酚，通过单因素试验和均匀试验优化了提取工艺。最优工艺条件为：乙醇体积分数45%，纤维素酶添加量0.06%，酶解pH 值2.5，酶解时间108 min，酶解温度70 ℃。在最优条件下提取香蕉皮多酚，多酚得率为2.989 mg/g。罗兰等采用螯合剂辅助提取香蕉皮多酚得率为1.614%，杨贤松等采用乙醇提取，利用正交试验优化香蕉皮多酚提取工艺，多酚得率为1.46%，吴德智等采用乙醇提取，利用Box-Behnken 响应曲面设计优化提取工艺，多酚得率为1.97%，可见，与单一提取方法相比，超声波辅助酶法提取可显著提高多酚得率。对香蕉皮多酚提取物进行了抑菌性测定，结果表明香蕉皮多酚提取物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果较好。下一步将开展香蕉皮多酚单体成分结构和活性方面的研究。