壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物在果蝇体内生物活性的研究

温舫，赵智宏，钟志梅,2,3*

(1.内蒙古农业大学理学院，内蒙古 呼和浩特 010018； 2.内蒙古自治区土壤质量与养分资源重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018； 3.农业生态安全与绿色发展自治区高等学校重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018)

0 引言

生物机体功能随着年龄的增长而退化，衰老是各种组织和器官的正常过程，衰老的影响体现在各种行为上，如：寿命、运动活力和生殖能力[1]，也与氧化产物自由基有关。一般情况下，体内的氧化和抗氧化活性保持在稳定状态，但随着年龄增长，大量活性氧(ROS)代谢为自由基，导致细胞氧化损伤和衰老[2]。Li等[3]的研究表明，人体可以通过一系列酶系统抵抗衰老的影响，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)，这些酶可以提高抗氧化活性。果蝇作为良好的模式生物，具有繁殖速度快、生长周期短、易于维护和操作、防御系统和衰老基因与人类相似等优点[4]。在过去的几十年里，果蝇已经成为研究人类相关疾病和衰老机制的新兴和有价值的模型。通过对果蝇生存时间等测定，研究了果蝇衰老，基于雌性和雄性果蝇之间的差异，雌性果蝇构成了更适合抗衰老研究的生物模型。

甲壳素是一种丰富的自然资源，其在自然界中储量仅次于纤维素[5]。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基产物，是一种可再生的天然碱性多糖，无毒、无副作用，具有良好的生物相容性、抗菌性、抗氧化性、可降解性等优异性能，应用前景广泛[6-8]。磺胺类药物具有抗菌谱较广、性质稳定、使用简便等优点[9]。将磺胺类有效基团与壳聚糖反应得到的壳聚糖磺胺类衍生物具有较好的体外抗菌、抗氧化性能[10]，为研究该类壳聚糖衍生物的体内抗氧化活性情况，文章以果蝇为研究对象进行系统研究。

1 实验内容

1.1 实验仪器与试剂

1.1.1 实验仪器

BCD-301WECK 冰箱，合肥美菱股份有限公司；G90F25CN3L-C2(G1) 微波炉，广东格兰仕微波生活电器制造有限公司；Mettler-Toledo XP6 微量天平，瑞士梅特勒托利多公司；HC-3018R 高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；UV-1600 紫外分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；YXQM 行星研磨机，长沙米淇仪器设备有限公司。

1.1.2 实验试剂

壳聚糖(分子量分别为200 kDa、3 kDa；脱乙酰度＞90%；青岛云宙生物科技有限公司)；对甲基苯磺酰胺壳聚糖(内蒙古农业大学理学院提供)；黑腹果蝇；琼脂；酵母粉；红糖、玉米粉(市售)；正丙酸(A.R)；无水乙醚(A.R)；无水乙醇(A.R)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 实验方法

1.2.1 壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对果蝇寿命的影响

(1)培养基的配制

称取细玉米粉12.6 g、粗玉米粒4.2 g、红糖6.2 g、琼脂1.24 g置于烧杯中，加入200 mL蒸馏水，搅匀，微波炉加热煮沸至糊状，冷却至室温，加入1.4 g酵母粉和1.0 mL丙酸充分混合，分装在培养管中，每管厚度约为2 cm，用无菌棉球封口，由此制得基础培养基。

称取细玉米粉6.3 g、粗玉米粒2.1 g、红糖3.1 g、琼脂0.62 g置于烧杯中，加入100 mL蒸馏水，搅匀，微波炉加热煮沸至糊状，冷却至室温，加入0.7 g酵母粉和0.5 mL丙酸充分搅拌，加入0.005 g、0.015 g、0.025 g、0.035 g、0.045 g的高低分子壳聚糖原料及高低分子对甲基苯磺酰胺壳聚糖，制得浓度为0.005%、0.015%、0.025%、0.035%、0.045%的药物培养基，搅拌均匀，倒入培养管中，每管厚度约为1 cm，用无菌棉球封口，由此得到对照组和实验组培养基。

(2)果蝇寿命实验

将果蝇置于相对湿度为60%，温度为25 ℃的培养箱中，在基础培养基上培养7天，产卵后倒出母本果蝇，随后每隔8 h分一次雌雄果蝇，在基础培养基中继续培养15天。随机将雌雄果蝇装在对照组和实验组培养基中，每管放30只，每个浓度5个重复，每天一次计算每个试管中果蝇的死亡和存活情况，直到它们全部死亡。在此过程中，培养基每3～4天更换一次。最后计算出半数果蝇死亡时的存活天数为果蝇的半数寿命，全部果蝇的平均存活天数为果蝇的平均寿命，最后10只果蝇死亡时的存活天数平均值为果蝇的最长寿命。

1.2.2 壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对果蝇抗氧化能力的影响

(1)果蝇的培养和组织匀浆制备

取上述基础培养基中已饲养15天的雌雄果蝇，随机放入对照组和实验组培养基中，每管30只，每个浓度5组平行，在湿度60%、温度25 ℃条件下的培养箱中培养15天，乙醚麻醉，置于-80 ℃的超低温保存箱中，以便测定抗氧化能力。

取已冷冻的果蝇放入离心管中，加入研磨珠和一定量的生理盐水，使用研磨机研磨10 min后得到组织匀浆浑浊液，离心10 min，所得上清液倒入无菌离心管中，4 ℃保存备用。

(3)果蝇体内蛋白质含量测定

称取0.056 3 g牛血清蛋白用生理盐水定容至100 mL，向空白管、标准管和测定管中依次加入0.1 mL蒸馏水、标准液和果蝇组织匀浆，以及2 mL考马斯亮蓝显色剂，混匀，静置2 min，测定上清液在595 nm处的吸光度值分别记为A0、Ai、Aj，按式(1)计算蛋白质的含量，单位为g/L。

(4)果蝇匀浆液SOD活力测定

测定管中加入试剂1应用液、果蝇组织匀浆、试剂2、试剂3和试剂4应用液，混匀，37 ℃水浴40 min；对照管加入试剂1应用液、蒸馏水、试剂2、试剂3和试剂4应用液，混匀，37 ℃水浴40 min；加入显色剂，混匀，静置10 min，测定在550 nm处吸光度值分别记为Aj、Ac，按式(2)计算SOD活力，单位为U/mgprot。

(5)果蝇匀浆液MDA含量测定

测定管中加入试剂1、果蝇匀浆液、试剂2和试剂3；对照管中加入果蝇匀浆液、试剂1、试剂2应用液和50%冰醋酸；空白管中加入试剂1、无水乙醇、试剂2和试剂3；标准管加入标准品、试剂1、试剂2和试剂3。混匀，95 ℃水浴40 min，离心10 min，取上清液532 nm处测得吸光度值，按式(3)计算MDA含量，单位为nmol/mgprot。

1.2.3 壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对果蝇繁殖力的影响

用已分开培养好的雌雄果蝇，设置对照组和实验组各5管平行，每管5只，湿度60%、温度25 ℃培养箱中培养7天，除去亲本，以第一只果蝇成虫孵化出为第一天，统计出10天内孵化成虫的总数为F1代数量。与此同时，将F1代果蝇收集并将雌雄分别培养，7天后去除亲本，从第一只果蝇成虫孵化出为第一天，统计10天内孵化成虫总数为F2代数量。

1.2.4 数据处理

采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 5.01软件进行统计分析和作图，结果均采用的方式表示。

1.3 结果与讨论

1.3.1 壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对果蝇寿命的影响

每组果蝇的半数寿命、平均寿命和最长寿命如表1所示。分析实验结果表明，相比空白对照组，对于雄性果蝇来说，在饲养对甲基苯磺酰胺高低分子壳聚糖过程中，半数寿命呈现随浓度增大而减少的趋势；在0.005 g/mL浓度下，果蝇最长寿命达到峰值，分别是60.3±0.89天和61.28±0.87天，对比壳聚糖原料的最长寿命(51.44±1.14天和54.16±4.1天)显著延长，差异具有统计学意义。对于雌性果蝇而言，实验浓度范围内，在饲养对甲基苯磺酰胺高低分子壳聚糖记录的半数寿命、平均寿命和最长寿命，与在饲养壳聚糖原料相比较未观察到显著变化，在0.045 g/mL浓度下，喂养MBSAHCS的果蝇最长寿命更优于HCS。以上结果说明衍生物能在一定浓度下通过诱导果蝇的氧化应激适应性能，提高体内抗氧化活性，从而延长果蝇寿命。通过对比雌、雄性果蝇，发现雌性果蝇寿命比雄性果蝇寿命更长，这可能由于雌、性果蝇对于衍生物的耐受程度不同，这与秦永燕等[11]研究的黄芪多糖对雌雄果蝇寿命的影响结果一致，与王娟等[12]关于香椿子对果蝇寿命研究结果相一致，而与蒋炎炎等[13]关于啤酒对果蝇寿命的影响的研究相反，这可能与雌雄果蝇在体质和生理代谢方面的差异有关。

表1 不同浓度壳聚糖及其衍生物对果蝇寿命的影响

1.3.2 壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对果蝇抗氧化能力的影响

(1)壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对果蝇体内MDA含量的影响。

氧自由基在人体新陈代谢过程中产生的生物膜可以攻击多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化，并形成脂质过氧化物醛基(丙二醛)等。MDA的含量通常用于显示脂质过氧化在体内的程度，并间接体现细胞损伤的程度[14]图2、图3分别是壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对雄性、雌性果蝇体内MDA含量的测定结果。对于高分子量浓度来说，在浓度为0.015 g/mL时，饲养MBSAHCS的果蝇MDA含量较HCS显著降低且抗氧化活性较强；对于低分子量浓度为0.005 g/mL时，饲养MBSALCS的果蝇抗氧化能力稍优于LCS。对于雌性果蝇而言，在饲养浓度为0.005 g/mL的MBSALCS时，果蝇体内的MDA含量到达峰值且抗氧化能力较弱。另外，雄性果蝇体内MDA含量显著高于雌性果蝇，同时这也与雌性果蝇寿命比雌性果蝇长的结果相呼应。

图2 壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对雄性果蝇体内MDA含量的影响

图3 壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对雌性果蝇体内MDA含量的影响

(2)壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对果蝇体内SOD活力的影响。

生物体内的各种生物过程会产生活性氧(ROS)，从而导致氧化应激，为了应对这种氧化应激，生物体可以利用超氧化物歧化酶(SOD)来清除活性氧，从而保护细胞内环境的稳定性[15]。超氧化物歧化酶(SOD)是直接清除自由基的酶，具体来说，SOD以高特异性和高效率将超氧化物分解成氧气和过氧化氢[16]。图4、图5分别是壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对雄性、雌性果蝇SOD活力的测定结果，对于雄性果蝇来说，饲养浓度为0.005 g/mL的MBSALCS的果蝇，SOD活力显著提升并达到峰值且抗氧化活性强，这与果蝇寿命实验结果相对应。MBSAHCS和HCS的结果相差不大。对雌性果蝇，在浓度为0.035、0.045 g/mL时，MBSAHCS更优于相同浓度下HCS的SOD值，抗氧化活性更优。总体上雌性果蝇的SOD值明显优于雄性果蝇，印证了果蝇寿命实验的结果。饲养对甲基苯磺酰胺壳聚糖在一定浓度能增加果蝇的SOD活力，可能是因为有大量的羟基取代基在药物中存在，有一定的还原能力，使果蝇抗氧化活性增强。

图4 壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对雄性果蝇SOD活力的影响

图5 壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对雌性果蝇SOD活力的影响

1.3.3 壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对果蝇繁殖力的影响

图6、图7分别是壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对果蝇繁殖力影响的测定结果。对F1代，MBSAHCS在0.015 g/mL和0.035 g/mL浓度下对果蝇繁殖力的抑制率较高；在0.015 g/mL浓度时，MBSALCS对果蝇的抑制率最高值为49.07±2.68%，在0.005 g/mL浓度时，对果蝇繁殖力抑制率为18.06±1.05%，与壳聚糖原料基本相同。对F2代，衍生物对果蝇繁殖力的抑制率都随药物浓度的增加而升高，MBSALCS在0.045 g/mL浓度时抑制率达到100%，可能是由于F2代药物毒性的累积，产生了抗药性。果蝇一系列的生物活动都是由保幼激素和蜕皮激素协调的，它们控制着胚胎发育、蜕皮、变形和繁殖[17]。实验表明，衍生物或多或少都会对果蝇的繁殖力造成有害影响，这可能由于磺胺类衍生物长期的饲养，抑制了蜕皮激素的释放致使果蝇生长发育缓慢，也可能由于衍生物导致激素分泌异常。

图6 壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对果蝇繁殖力影响(F1)

图7 壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对果蝇繁殖力影响(F2)

2 结语

生物体的衰老是一个多因素作用的复杂过程，多种抗氧化酶是机体防御系统中极其重要的部分，可以维持活性氧的动态平衡，防止过量的活性氧对机体造成氧化损伤。SOD能清除有害的自由基，防止对机体的损伤，MDA能体现细胞损害程度。果蝇是一种广泛应用的模式有机体，在衰老研究中具有明显的优势，包括寿命短、维护要求低、遗传资源丰富和易于进行遗传操作。在研究中，选择果蝇模型来研究不同浓度下的壳聚糖及其对甲基苯磺酰胺衍生物对果蝇的寿命及繁殖能力的影响，并测得果蝇体内MDA含量和SOD活力作为检测抗氧化能力的指标。研究结果表明，雌性果蝇对比雄性果蝇寿命更长，衍生物对雌性果蝇的存活时间影响不大，证明衍生物在一定浓度使用下有较好的抗氧化能力。衍生物在0.005 g/mL浓度下，果蝇最长寿命达到峰值且果蝇体内MDA含量低，SOD活力最高，并且都高于雄性果蝇，说明存在性别差异。对甲基苯磺酰胺衍生物在一定浓度下能减弱果蝇衰老，从而延长果蝇寿命，提高体内抗氧化活性。由此看来，果蝇的存活时间和繁殖能力与生物体的氧化损伤有着直接关系，药物可能利用降低体内抗氧化能力从而降低果蝇存活时间和繁殖能力。对甲基苯磺酰胺衍生物影响果蝇生长发育的因素是多方面的，还需要进一步研究探索。