基于PCR快速检测分析某院ICU患者中CRE菌株耐药特点

花鸿燕，包海林，戴绘芬

(江苏省海安市中医院检验科，江苏 海安 226600)

抗碳青霉烯类肠杆菌(carbapenem-resistant enterobacter，CRE)作为一组肠道杆菌，包含70多种细菌，如大肠埃希菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌等，常导致免疫力低下或受重大感染的患者形成由切口、泌尿道等部位的感染[1]。近年来随着CRE抗菌药物在临床中的大量应用，CRE的检出率也不断上升，且由于CRE菌株对CRE广谱抗生素具有极强的耐药性，因此感染CRE的患者病死率非常高[2]。有研究表明，在CRE菌株中检测到Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase 1,NDM-1)基因，而NDM-1具有使碳青霉烯类或其他β-内酰胺抗生素功效降低甚至丧失的特点，因此含有NDM-1基因的CRE菌株会对大多数抗菌药物产生耐药性，从而限制临床治疗，导致严重的临床感染，影响患者的生命健康[3]。有数据显示对含NDM-1基因的CRE菌株易感人群主要包括重症监护室(intensive care unit，ICU)患者、行机械通气者及长期服用抗菌类药物者，因此，在临床上若对CRE感染者使用抗菌药物效果不显著时，应考虑其感染的细菌否含有NDM-1基因[4]。现阶段针对CRE治疗的方式非常有限，且不同地区CRE感染所含基因型也各不相同，医院作为大型医疗场所，若不及时控制CRE散播，则可能造成严重的院内感染[5]。因此本研究通过对某院ICU患者进行相关流行病学调查，并进一步分析CRE感染及耐药情况，为预防CRE大面积传播提供科学参考依据。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料及菌株来源 选取2020年3月—2021年5月江苏省海安市中医院收治的ICU患者150例，其中男性87例，女性63例，年龄53～68岁，平均(64.31±3.31)岁，进ICU时间2～8 d，平均(4.24±1.52)d，检测菌株来源主要包括尿液、血液、痰液等标本，剔除同一患者相同部位分离出的同种菌株。

1.2仪器与试剂 SPUBACT细菌培养基(型号为Ⅲ-3)由武汉迪艾斯科技有限公司提供；全自动微生物测定仪(型号为Walk Away-96 Plus)由西门子医学诊断产品有限公司提供；细菌鉴定及药敏测试卡由法国生物梅里埃公司提供；电泳仪由美国Bio-Rad公司提供；聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪由美国Bio-Rad公司提供；细菌DNA提取试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供；PCR试剂由上海生物工程有限公司提供。质控菌株包括大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、金黄色葡萄球菌ATCC25922。

1.3实验方法

1.3.1细菌培养及CRE提取方法 对ICU患者无菌操作获取标本后，立即送往微生物室进行鉴定，按照《全国临床检验操作规范》对所采集到的临床标本进行培养，使用全自动微生物测定仪对菌种进行鉴定，采用纸片扩撒法进行药敏试验并根据食品药品监督管理局所颁布的判定标准确定药敏结果，挑取过夜培养后的单个纯菌落，通过VITEK-2系统配套的GN鉴定卡和AST-GN14药敏卡完成CRE菌株的筛选。采用改良Hodge试验检测碳青霉烯酶：将生理盐水与将大肠埃希菌ATCC 25922菌悬液调至0.5麦氏浊度，并稀释生理盐水(1∶10)；棉签蘸取稀释后的菌液均匀涂于MH琼脂皿上，干燥5 min；将美罗培南纸片置于MH琼脂皿上；挑取3～5个过夜生长菌落﹐垂直于药敏纸片﹐从纸片边缘开始划长度20～25 mm的直线线并进行细胞培育，20 h后如果在被测菌株与大肠埃希菌ATCC25922抑菌圈交汇处，大肠埃希菌生长增强，即为产碳青霉烯酶。

1.3.2PCR扩增测定CRE菌种基因型 采用PCR扩增测定CRE菌种中耐药基因型，并采用煮沸法提取细菌DNA模板。具体内容包括：①PCR扩增反应体系总体积为25 μL，其中包括2 μL模板DNA、2 μL dNTP混合物、2 μL Mg2+plus缓冲液、2 μL引物(引物序列为F：5′-GAGATTGCCGAGCGAC-TTC-3′；R：5′-TACCGCCTGGACCGATGAC-3′)、0.3 μL rTap，使用16.7 μL实验室无菌水调配至25 μL反应体系；②在94 ℃条件下进行5 min预变性反应，94 ℃条件下进行40 s变性反应；在52～58 ℃条件下进行40 s退火处理，在72 ℃下进行5 min伸延处理，共30个循环，再经72 ℃终延伸10 min，所测序列在GenBank中通过BLAST程序进行序列比对，确定所测细菌的基因型；③经电泳成像结果进一步确定基因型。

1.4观察指标 ①分析ICU患者CRE菌种在不同标本中的检出情况；②分析CRE菌株对临床中常用抗生素的敏感性与耐药性；③观察不同基因型在CRE菌种中的检出率。

1.5统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CRE菌种在ICU患者标本中的检出及分布情况 在150例患者中共分离出643株肠杆菌，其中痰液中存在肠杆菌及CRE菌种占比最高，分别为41.06%及44.85%，在分离出的165株CRE菌株中，主要以黏质沙雷菌为主，占26.06%，其次为肺炎克雷伯菌(23.64%)及阴沟肠杆菌(20.00%)，见表1～2。

表1 CRE菌株在不同标本中分布情况Table 1 Distribution of CRE strains in different specimens

表2 CRE种类分布及构成比Table 2 CRE species distribution and composition ratio

2.2主要CRE对常用抗菌药物的耐药情况 CRE菌株对大部分β-内酰胺类抗菌药物耐药度较高，而敏感度越高药效越好，其中敏感程度最高的为替加环素(100%)，其次为环丙沙星(80.00%)及阿米卡星(74.55%)，见表3。

表3 主要CRE菌种对常用抗菌药物的耐药情况Table 3 Resistance of main CRE strains to commonly used antibiotics (例数，%)

2.3CRE菌株的不同基因型 在165株CRE菌株中产DNM-1基因的菌株数量最多，占58.79%，其次为KPC与VIM，分别为23.03%及18.18%，见表4、图1、2。

表4 CRE菌株基因型统计Table 4 Genotype statistics of CRE strains

图1 NDM-1基因在CRE菌株中测序图)

图2 CRE菌株中不同基因型泳道

3 讨 论

肠杆菌在临床上常引起泌尿道、呼吸道等感染通常使用抗生素进行抗菌治疗与此同时，细菌的耐药性也不断增强[6]，严重阻碍临床治疗。研究表明，CRE的耐药机制主要有以下几个方面，首先是菌体产生抗生素灭活酶，即碳青霉烯酶，这是目前临床中多数学者认同的CRE耐药机制[7]。碳青霉烯酶作为B类金属酶的一种，还包括常见的ESBL、AmpC酶等，其形成会导致细菌对大多数抗生素形成耐药性[8]。其次，由于产ESBL、Ampc酶过多合并孔道蛋白缺失或机体外排泵功能失衡，导致细胞膜通透性降低，也会增强CRE的耐药性[9]。另外，有学者指出，抗生素作用靶点PBPs出现异常，也会导致细菌耐药性增强[10]。本研究结果显示，CRE菌种在黏质沙雷菌及肺炎克雷伯菌中检出率最高，分别为26.06%及23.64%，说明某院内CRE流行的主要致病菌为黏质沙雷菌及肺炎克雷伯菌，同时本研究显示CRE菌株对头孢类药物及美罗培南存在较高的耐药性，但对替加环素的敏感度较高，与Alizadeh等[11]研究结果一致。提示当临床中应用新型抗菌药物，细菌耐药性也伴随产生，在抗生素初始应用阶段，细菌对不同抗菌药物的的耐药性处于极低水平，且对常见病原菌的敏感率较高，与临床中常见的β-内酰胺类药物一致，CRE类在临床应用后也会相应的出现CRE菌株[12]。由于头孢类抗生素在临床上已应用多年，因此临床中大部分致病菌对其耐药性偏高，但主要致病菌对碳青霉烯类的耐药较低，其耐药机制主要有青霉素与蛋白结合程度降低；Ⅰ型β-内酰胺酶水解碳青霉烯类的微弱活性伴随细菌对碳青霉烯类通透性下降，导致细菌耐药性不断增强，常见于肠杆菌或绿脓杆菌等菌株；菌株产生含锌β-内酰胺酶水解碳青霉烯类[13-14]。提示在对ICU患者用药过程中，避免长期使用同一种抗生素，使细菌耐药性上升。

此外，本研究还对CRE菌种中含有的基因型进行PCR快速检测分析，结果显示含NDM-1基因的CRE菌株比例最高，可达58.79%。由于NDM-1基因位于质粒，因此其可在质粒的介导下在多种细菌之间进行传播，引起如腹膜炎、肺部感染等多种感染性疾病[15]。研究表明，含有NDM-1基因的CRE菌株含有更强的耐药性，其原因之一是由于多数具有活性的NDM-1主要以单链状态存在于机体水液中，但当部分NDM-1的疏水性及范德华力产生差异时，其在液体中的呈现方式从单链状态转变为二聚体状态，因此当其以二聚体状态嵌入细菌细胞膜时，会使细菌耐药性增强[16]。还有学者指出NDM-1中的二价锌离子能够与不同His配位呈ZN1及ZN2，并嵌于蛋白表明，与周围溶剂充分接触，并表现出更强的底物结合力，从而提高细菌的耐药机制，但此机制尚未需进一步论证[17]。本研究表明，携带DNM-1基因的细菌在临床中表现为耐药性较广的特点，其作为一种高效酶，能够水解大部分β-内酰胺类药物，且本研究检测出NDM-1基因型的细菌表现对多数头孢菌素类药物及美罗培南具有较高耐药性，而其他细菌表现出多重耐药性推测与DNM-1基因表达较低有关[18]。因此应加强对ICU患者用药管理，尽量选取替加环素等敏感度较高的抗生素，控制院内CRE菌种的传播。

综上所述，某院ICU患者所感染的CRE杆菌多为黏质沙雷菌，其次为肺炎克雷伯菌及阴沟肠杆菌，经过PCR快速检测分析出CRE菌种中主要基因型为NDM-1，但据研究显示，改良Hodge试验虽具有较高敏感度，但临床检测中易出现假阳性，提示本研究结果或许存在一定偏差，需进一步对其监测，为临床用药提供可靠依据。