植物内生菌研究进展

李 港 刘博文 王子晗 王彦彦 高崇玉

（新乡医学院三全学院，河南新乡 453000）

植物内生菌是指整个生命活动都在宿主各细胞间隙、组织和器官内，而不会对宿主产生严重危害和引起宿主产生排斥反应的微生物[1-2]。内生菌种类多样、分布广泛，主要概括为内生真菌、内生细菌和内生放线菌三个大的种类，其与宿主之间存在着和谐联合的关系[3]。由于内生菌寄生于宿主中，随着生物的进化发展，内生菌不仅获得了与宿主产生相同或相似产物的能力，还具有产生宿主所不能产生的物质的能力。植物内生菌因与宿主间存在共生关系，其次级代谢产物可影响宿主植物的物质代谢、能量代谢，提高宿主植物对生物（寄生虫、害虫和动物等）或非生物（温度、pH值、盐、碱、重金属、紫外线、水分和海拔等）胁迫的耐受性[4-5]，有效保障宿主植物良好的生长发育。由于内生菌的代谢产物非常丰富，具有很高的临床研究价值，已成为医学界科研人员探索的宝库之一。

1 内生菌的分离与纯化

1.1 传统的分离与纯化

1.1.1 内生真菌的分离与纯化。内生真菌分离与纯化基本上是先用乙醇与次氯酸对植物表面消毒，然后剪成小份放入PDA培养基中培养分离。例如，赵作威等[6]提取白花蛇舌草内生真菌时，依次用75%乙醇浸泡30 s、3% NaClO溶液浸泡60 s、75%乙醇浸泡30 s对白花蛇舌草进行表面消毒，然后将白花蛇舌草各部分剪成小块放入PDA培养基上培养，当观察到培养基上有真菌长出时，及时接种到新的PDA培养基上进行纯化培养。也有部分研究者用0.1%升汞代替其他化学消毒剂来进行植物表面消毒[7]。杨帆等[8]提取药用植物内生真菌时，先用70%乙醇浸泡各组织5 s后，根、茎、果经0.1%升汞浸泡1.5～2.0 min，叶、花经0.1%升汞浸泡30～45 s，进行表面消毒，然后接种在含有链霉素（400 μg/mL）的PDA平皿上进行分离纯化。

1.1.2 内生细菌的分离与纯化。耿 直等[9]用堇叶碎米荠提取内生细菌时，先将组织依次浸泡于75%乙醇（根和茎浸泡2 min，叶浸泡1 min）和2%次氯酸钠（根和茎浸泡5 min，叶浸泡3 min）中消毒清洗，然后用75%乙醇清洗；最后研磨，将研磨液稀释涂布于NA培养基上，通过分离划线进行分离纯化。高 磊等[10]用新疆牛至提取内生细菌，首先用75%乙醇消毒3 min、5%次氯酸钠消毒5 min，再用普通培养基进行消毒测验；然后研磨，将研磨液加入TSB液体培养基中培养，最后用分区划线法进行内生细菌纯化。代亚锋等[11]对表面消毒方法进行了改进，茶树叶表面消毒采用3.0%过氧化氢浸泡3 min，研磨后稀释成不同浓度梯度，各取100 μL涂布于NA培养基上，37℃培养，分离纯化采用平板划线法。

1.1.3 内生放线菌的分离与纯化。内生放线菌的分离与纯化表面消毒与内生真菌和内生细菌大致相同，但针对不同样品时，有些会添加其他物质来增强表面消毒的程度和采用不同的培养基选取目的菌株。例如陈 雷等[12]在利用大叶藻进行内生放线菌的分离纯化时，用无菌海水进行了冲洗，涂布于7种固体分离培养基（2216E、HV、ISP2、M2、SCA、R2A、RO）上进行培养、分离与纯化。李 蜜等[13]利用海南西海岸红树林伴生植物提取内生放线菌时，利用了9种分 离 培 养 基 （AGG、M4、M5、M7、M9、M10、ISP7、ISP3和M11）进行分离培养。雷艳娟等[14]对新疆13种荒漠植物根内生放线菌进行分离纯化时，采用的是SCA培养基和高氏一号培养基。

1.2 辅以高通量测序技术的分离与纯化

高通量测序技术可以先对定殖于植物里的内生菌的结构和多样性进行整体了解，找到在宿主中生活良好的菌株，分析其全基因组；然后从基因层面了解优势菌株的生物特性并设计针对该优势菌株的分离方法，有针对性地选择培养基；最后对分离菌株进行生物活性研究。内生菌分离与纯化时，传统方法辅以高通量测序技术可以大大减少研究者漏筛有价值功能菌株的情况，扩大内生菌的研究范围，有利于内生菌的深入挖掘和利用[15]。李 越等[16]对紫萍内生菌进行研究时，选用Illumina MiSeq高通量测序技术测定紫萍内生细菌的16S rDNA序列，使用FLASH、UCHIME和UPARSE等软件整理和统计数据结果。

2 内生菌次级代谢产物的生物学活性

内生菌依附于宿主植物并从中获得营养，通过物质和能量代谢产生的物质称为次级代谢产物[17-18]。随着生物的进化发展，内生菌具备了产生宿主不能产生的有研究价值的生物活性物质的能力[19]。例如：李春鹤[20]从雷公藤内生真菌Talaromyces amestolkiae CS-O-1次级代谢产物中分离得到14个化合物，并通过质谱及核磁共振等手段鉴定了7个化合物，包含 1个新化合物 chrodrimanin T（1）和6个已知化合物，分别为烟酰胺（2）、penipyridoneD（3）、penipyridone A（4）、3-benzylidene-8，8a-dihydroxy-2-methyl-hexahydro-pyrrolo[1，2-a]pyrazine-1，4-dione（5）及 aspergillumarin A（6）、邻苯二甲酸丁基异丁酯（7）；李 婧等[21]从朝鲜淫羊藿中鉴定出6株内生真菌，且6株内生菌代谢产物均含有黄酮类成分，含量范围为0.09～0.22 mg/mL。

2.1 抑菌作用

蒋诗林等[22]对美洲大蠊肠道内生放线菌的抗菌活性进行了研究，体外抑菌试验显示，49株内生放线菌次级代谢产物均对金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）有不同程度拮抗作用，且11株内生放线菌对2种指示菌株都有拮抗作用，表明内生放线菌对肠道菌有先天抑菌优势，其中链霉菌属占大部分，发挥了主要抗菌作用。李玲玲[5]从青蒿中分离出19株内生细菌，18株有抑菌活性；34株内生放线菌，14株有抑菌活性，抗菌谱较窄，对酿酒酵母的抑菌效果好；23株内生真菌，8株有抑菌效果。雷丹丹等[23]研究内生菌Aspergillus terreus PC-038的次级代谢产物发现，1，2-二氢烟曲酶酸和烟曲霉酸对标准金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，最低抑菌浓度（MIC）分别为 8 μg/mL 和 4 μg/mL。 吾尔恩·阿合别尔迪等[24]从天山雪莲中分离出8株内生真菌，其中菌株N4和N7的代谢产物具有抑菌活性。N4菌株代谢产物对目标菌株均有拮抗作用，从小到大依次为人体肠道内具有传染性、在一定条件下可引起胃肠道疾病的大肠埃希菌和常见的食源性致病菌金黄色葡萄球菌、条件致病的腐生寄生真菌白假丝酵母菌、可以分解色氨酸的需氧菌枯草芽孢杆菌。马逢时等[25]从白花前胡中筛选到25株菌株，其中：MG-1对金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度达到0.059 mg/mL；利用LC-MS鉴定MG-1和白花前胡的共有代谢产物，分别为紫花前胡素、珊瑚菜内酯、白花前胡丁素。

2.2 抗肿瘤作用

张建芬等[26]从华泽兰中提取到8株内生菌，其醋酸乙酯提取物对人乳腺癌细胞都表现出不同程度的抗肿瘤能力，其中效果最明显的是菌株EC102、EC108。李俊峰等[27]从野生铁皮石斛中分离纯化内生菌，并提取内生菌次级代谢产物，用MTT法检测内生菌TG2代谢产物是否具有抗肿瘤活性，发现菌株TG2的代谢产物具有较好的抗肿瘤活性，且抗肿瘤活性与剂量成正比。代金霞等[28]对宁夏枸杞内生菌的研究发现，有4株菌株对肿瘤细胞Hela和A549的生长具有抑制作用，其中菌株FL1对Hela和A549的抑制率分别达78.8%、89.2%，FL6对Hela和A549的抑制率分别达到65.7%、55.7%。

2.3 抗氧化作用

赵倩倩等[29]从碱蓬中分离纯化得到了6株内生真菌，其中产黄青霉属无性型真菌具有较高的清除DPPH自由基的作用，利用核磁共振波谱的方法鉴定其次级代谢产物为2个甾体类化合物。王俊丽等[30]从太子参块根中分离内生真菌，试验数据显示：内生菌不同提取物清除DPPH自由基的IC50值存在较大差别，有的提取物IC50值高达近300 mg/mL，而有的却不到1 mg/mL；清除·OH自由基的IC50值与清除DPPH自由基的IC50值变化规律相同，清除能力好的IC50值高达946.221 mg/mL，清除能力差的IC50值低至1.053 mg/mL。表明内生真菌次级代谢产物的活性存在差距，获得优势菌株对试验研究与临床药物研究具有重要价值。韦琮智等[31]在研究银杏内生菌的胞外多糖时，经过脱蛋白、透析、层析得到2种多糖组分（EPS1-1和EPS2-1），一个为酸性多糖，一个为中性多糖，多糖的相对分子质量、体积和黏度等都会影响其抗氧化活性。采用控制单一变量原则进行研究，结果表明，这2种胞外多糖均有一定的还原力和清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基、对羟自由基的能力，其中对DPPH自由基的清除能力较强，当质量浓度达到0.1 mg/mL时，EPS1-1和EPS2-1对DPPH的清除率分别达到34%和48%。

2.4 其他生物活性

有科研人员对2 700多种内生真菌提取物进行了抗利什曼原虫活性筛选，发现有高达17%的菌株具有抗寄生虫活性，其中活性较强的菌株属于蜜环菌科、毛球菌科和羊驼科。也有学者研究太子参内生芽孢杆菌RPB-32代谢产物（BM）对小鼠肠道微生物组成的影响，认为内生芽孢杆菌代谢产物可能对机体降糖降脂、抗感染和抗炎等方面有增强作用[32]。研究者从雷公藤中分离出内生真菌，其中踝节菌属（Talaromyces）对乙酰胆碱酯酶具有中等程度的拮抗作用[33]。

3 总结与展望

现有研究表明，内生菌含有丰富的黄酮类、甾体类、萜类等活性物质，能成为新药物研发的重要来源。但目前内生菌分离大多采用传统的方法，有学者表明，此种方法并不利于内生菌的充分利用。另外，研究内生菌代谢产物要求试验人员和实验室具备较好的试验能力和技术条件，这也是限制内生菌深入研究的壁垒之一。因此，本文综述了植物内生菌的研究进展，以期为研究者深度挖掘内生菌的价值提供参考。