肺炎克雷伯菌逃避中性粒细胞免疫的机制

王蕾蕾， 王明贵， 杨 帆

肺炎克雷伯菌是临床分离常见的革兰阴性杆菌[1]，可引起肺炎、血流感染、肝脓肿和眼内炎等多种疾病。根据毒力和致病特点，肺炎克雷伯菌可分为普通肺炎克雷伯菌（cKP）和高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）[2]。

固有免疫是生物在长期进化过程中逐渐形成的，是机体防御病原微生物入侵的第一道防线，其中中性粒细胞在免疫防御中至关重要。感染初期，中性粒细胞从外周血被迅速趋化募集至感染部位，进而通过吞噬、中性粒细胞胞外诱捕网（NET）、脱颗粒和活性氧（ROS）等方式发挥直接抗病原微生物感染作用。中性粒细胞还能与其他免疫细胞（巨噬细胞和树突状细胞等）协同清除病原体[3]。

肺炎克雷伯菌能通过多种途径逃避机体中性粒细胞的防御作用，本文就此作一综述，以期更好地理解肺炎克雷伯菌感染。

1 抗吞噬并抑制ROS生成

中性粒细胞可伸出伪足对病原体进行抓捕并吞噬，细胞膜内陷包裹病原体形成吞噬小体，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶复合体组合、活化并嵌入吞噬小体的脂质双分子层，通过呼吸爆发产生大量的ROS杀伤病原体[4]。此外，中性粒细胞存在各级颗粒，包括初级颗粒（也称嗜天青颗粒）、次级颗粒（也称特异性颗粒）、三级颗粒和分泌囊泡[5]。这些颗粒可向吞噬小体内分泌髓过氧化物酶（MPO）和弹性蛋白酶（NE）等抗菌物质，进一步增强对病原体的杀伤。

肺炎克雷伯菌的荚膜多糖和脂多糖（LPS）可抵抗中性粒细胞的吞噬和杀伤作用[5]。Wang等[6]通过透射电镜观察到hvKP被中性粒细胞吞噬后，菌体细胞壁完整，并且可见细菌分裂、繁殖现象，而cKP菌体细胞壁不完整且菌体开始裂解。Pan等[7]敲除了高毒力肺炎克雷伯菌NTUH-K2044的蛋白酶ClpX和LPS的O抗原转运体Wzm后，发现敲除株的荚膜减少，使得人中性粒细胞对其吞噬率明显高于野生株。

果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBA）也能作为与中性粒细胞的交互因子，有助于肺炎克雷伯菌抗中性粒细胞吞噬，但具体机制有待进一步研究[8]。FBA分布于K1血清型肺炎克雷伯菌的细胞质和外膜中，是糖酵解和糖异生途径的中心酶[8]。

肺炎克雷伯菌的荚膜多糖还抑制中性粒细胞生成ROS[9]。ST258型肺炎克雷伯菌细胞壁组分LPS的脂质A组分通过Toll样受体4（TLR4）传递信号，使之被中性粒细胞识别，而多糖组分可能通过另一种受体传递负性信号来抑制ROS[10]。

2 抑制NET生成

NET是由中性粒细胞形成并释放到胞外的纤维网状结构，包括DNA、组蛋白、MPO、NE、抗菌肽和钙颗粒蛋白等[11]。NET能捕获病原体，限制病原体的扩散；NET内抗菌物质富集，有利于降解毒力因子，也有助于清除病原体。佛波酯（PMA）、LPS、钙离子载体以及细菌、病毒和寄生虫等微生物均可诱导NET形成。NET的形成过程称为NETosis，这不同于细胞坏死和凋亡，是一种新型的细胞程序性死亡方式。

目前认为NETosis可通过以下3 种模式发 生[12]：①依赖NADPH的NETosis。当中性粒细胞被刺激后，细胞外信号调节激酶（ERK）级联反应被激活，NADPH氧化酶活化并产生ROS。ROS促进中性粒细胞颗粒解体，使NE和MPO进入细胞质。NE和MPO随后进入细胞核，剪切组蛋白，继而染色质解聚，核膜破裂，DNA、组蛋白和蛋白酶等进入细胞质，共同组成NET。随后，胞膜破裂，NET释放至胞外[13]。②不依赖NADPH、依赖钙的NETosis。当细胞内钙离子增加，肽基精氨酸脱氨酶4（PAD4）与钙离子结合，进入细胞核，使组蛋白H3和H4上带正电荷的精氨酸残基转化为瓜氨酸。正电荷减弱使组蛋白从负电荷的DNA上解离，导致核小体解凝[14-15]。③NET的快速形成过程。在细菌所致感染中，NET能快速形成[13]。

Birnberg-Weiss等[5]发现，ST258型肺炎克雷伯菌干扰中性粒细胞释放初级颗粒，并抑制其生成NET，从而推测，这可能由于肺炎克雷伯菌抑制鸟苷三磷酸酶（GTPase）（如Rac2）活化，或结合中性粒细胞表面抑制性受体来干扰其脱颗粒。Wang等[6]则通过扫描电镜观察到血清型为K1型的高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP-K1）和cKP均能诱导NET的释放，但NET中hvKP-K1数量少，且hvKP-K1菌体表面未出现代表凋亡或死亡的“小孔”，这提示hvKP对NET的诱捕和清除具有抗性。

3 干扰中性粒细胞凋亡和胞葬

肺炎克雷伯菌干扰中性粒细胞凋亡及胞葬。胞葬作用（efferocytosis）是指在磷脂转位酶（如翻转酶）协助下，凋亡细胞增加胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸（PS），该“eat me”信号被吞噬细胞（巨噬细胞等）表面受体识别，进而使凋亡细胞被吞噬和清除。胞葬作用主要针对死亡或垂死的细胞，能终止炎症和感染。

Lee等[9]从肝脓肿患者体内分离出血清型为K1型的肺炎克雷伯菌即KP-M1，并将其突变为无荚膜株KP-DT-X，将两者均感染人中性粒细胞后，发现感染KP-M1的中性粒细胞可存活至感染后 24 h，而未感染和感染KP-DT-X的中性粒细胞在10 h内发生凋亡。因此，肺炎克雷伯菌的荚膜参与干扰中性粒细胞凋亡。此外，KP-M1通过下调Bax与Bcl-2、Mcl-1的比值来延迟中性粒细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase） -3的激活，诱导抗凋亡细胞因子白细胞介素（IL） -8，从而对中性粒细胞发挥抗凋亡作用[9]。也有研究发现，hvKP可通过上调p65蛋白表达，抑制NF-κB信号转导途径，导致中性粒细胞凋亡延迟[16]。

当肺炎克雷伯菌感染中性粒细胞时，维持生物膜磷脂不对称性分布的中性粒细胞磷脂翻转酶活性增强，通过水解ATP将PS从生物膜胞外侧转运至胞浆侧，中性粒细胞表面的凋亡信号PS减少，促凋亡caspase-3和caspase-7、caspase-8下调，正常凋亡途径受到抑制，同时巨噬细胞无法识别胞葬信号而无法有效吞噬该中性粒细胞。此外，坏死性凋亡相关的受体相互作用蛋白激酶RIPK1上调，RIPK3磷酸化，混合系蛋白激酶样结构域蛋白MLKL磷酸化后转位到质膜，坏死性凋亡程序被激活，从而导致中性粒细胞增多和炎症持续[17]。

此时被感染的中性粒细胞可能被肺炎克雷伯菌用作“特洛伊木马”，胞内的肺炎克雷伯菌随其迁移至宿主其他部位，导致感染的播散和转移，从而发展为一种独特的侵入性综合症[18]。

中性粒细胞是机体抵御外来病原体感染的重要免疫细胞，其防御机制较为多样。肺炎克雷伯菌也相应发展出一系列免疫逃避机制，但其深入机制仍有待研究。