外周组织活检病理在帕金森病诊断中的应用

朱啸巍 钟 平 栾兴华

1）安徽医科大学附属宿州医院，安徽 宿州 234000 2）上海交通大学附属第六人民医院，上海 200233

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见于中老年的神经系统变性疾病，临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍为主要特征，也可出现睡眠障碍、嗅觉障碍、自主神经功能障碍、认知和精神障碍等非运动症状。由英国医师PARKINSON 于1817 年首先报道并系统描述［1］。PD主要的病理特征是在残留的神经元胞浆内出现嗜酸性包涵体，即路易小体（Lewy bodies），其中α-突触核蛋白（α-synuclein）是形成路易小体的重要成分，分布于大脑、脊髓、颌下腺、肠神经、皮肤等［2］。

α-synuclein是一种小分子胞内蛋白，由140个氨基酸组成，主要存在于中枢神经系统，在生理条件下可调节神经元细胞膜的稳态，并且通过囊泡运输影响突触前的信号和膜运输，其错误折叠和聚集可在PD 发病过程中导致细胞损伤和死亡。已有大量的临床和临床前证据证实错误折叠的α-synuclein 参与了PD 的发病机制，细胞内错误折叠的α-synuclein 沉积形成路易小体，导致PD的发生，α-synuclein在中枢神经系统的脑干、前脑、锥体外系和大脑皮质区域先后沉积［3-4］。α-synuclein寡聚体对许多细胞过程有明显的损害作用，包括细胞膜、线粒体、内质网功能、神经炎症和突触传递等。影响α-synuclein 聚集的因素包括环境、点突变、C末端截断和翻译后修饰，如泛素化、磷酸化、硝化和氧化［4］。神经功能影像学对于PD的早期诊断及鉴别缺乏特异性及灵敏性，且PD的发病机制至今尚未明确，所以无法简单的用单一影像学生物标志物对PD患者的病理性α-synuclein进行评估［5-6］。近年来，人们在中枢神经系统以外的组织中也发现了α-synuclein 异常沉积，可能先于中枢神经系统出现［7］。外周活检为寻找准确可靠的PD早期生物标志物及临床前诊断提供了新的选择，但外周组织α-synuclein 沉积能否反映大脑黑质多巴胺神经元变性程度尚不确定，由于既往研究条件和方法不一致，如尸检或活检取材、选择部位、组织大小、制备过程、染色技术和所用抗体等，报道的外周α-synuclein检测敏感性和特异性也存在很大差异［2，8］。本综述基于活检病理，聚焦于皮肤、嗅黏膜或嗅球、胃肠道组织、周围神经等临床易获得的组织，评估其对PD 病理诊断的临床应用价值（表1）。

1 皮肤病理

皮肤组织结构丰富，且皮肤活检取材方便、创伤小。浅层活检（3～4 mm）可观察表皮神经纤维，深层活检（6～8 mm）则能提供足够的真皮组织来评估汗液、皮脂腺、毛囊和小血管。最近研究表明，PD发病时涉及自主神经系统，皮肤组织中自主神经纤维会出现病理α-synuclein 沉积，沉积程度与自主神经功能障碍、临床症状严重程度正相关，这可能部分解释PD 患者自主神经功能障碍，也有助于PD 的早期诊断和监测疾病进展［9-10］。

通过多种抗体免疫组织化学染色（immunohisto⁃chemistry，IHC）可以分析皮肤神经纤维的结构完整性，检测PD患者α-synuclein沉积［11］。其中，最常用的是蛋白基因产物9.5（protein gene product 9.5，PGP9.5），又称泛素羧基末端水解酶-1（ubiquitin C-terminalhydrolase；OCH-L1），广泛性表达在所有中枢和周围神经纤维上，可作为一种神经轴突标记物，抗PGP9.5 抗体可以与有髓及无髄神经纤维相结合。染色后用明视野显微镜或间接免疫荧光共聚焦显微镜观察可定量PD 患者的表皮内神经纤维密度（In⁃traepidermal nerve fiber density，IENFD），这是诊断小纤维神经病变的金标准［12］。多项研究表明，PD患者的IENFD 显著降低［13-14］，约有56.9%的PD 患者存在小纤维神经病变［15］。

早期PD 患者皮肤活检与前期尸检的脑组织中磷酸化α-synuclein 在结构上相似，且与天然α-synu⁃clein 相比，磷酸化α-synuclein 在PD 患者皮肤组织检出中具有更高的特异性和敏感性［16］。此外，真皮自主神经纤维内的α-synuclein在区分PD与其他非典型PD 方面也同样具有很高的敏感性和特异性。磷酸化α-synuclein 可表达在真皮的汗腺、自主神经末梢、靠近竖毛肌或血管的神经丛中等［17-18］。通过IHC 在真皮神经纤维中定量检测磷酸化α-synuclein 可作为最理想的外周组织病理学标志物，更适用于临床应用中，磷酸化α-synuclein 的检出率与切片厚度或取材部位相关，活检取材部位建议优先选择颈部（第7颈椎旁2 cm，阳性率66.7%）和下肢远端（外踝上方10 cm，阳性率42.2%）［19-20］。

2 嗅黏膜/嗅球病理

嗅觉减退是PD 常见的非运动性症状，且α-synuclein 存在于嗅黏膜和嗅球，嗅黏膜活检不会影响嗅觉，通过嗅黏膜组织的α-synuclein 病理观察，可能有助于PD的早期诊断，而嗅球的组织学检查仅限于尸检。

BEACH 等［21］在58 例PD 尸 检 嗅 球 中 发 现α-synuclein免疫组化染色的敏感性达95%，特异性达91%，认为嗅球α-synuclein 能准确预测大脑区域α-synuclein 的存在，但该研究结果的敏感性和特异性如此之高有待验证。嗅觉细胞的α-synuclein 检出率远低于嗅觉神经纤维束，嗅黏膜活检尚不能帮助诊断，其临床应用性仍值得商榷。嗅觉功能障碍与脑脊液中α-synuclein 水平升高有关，因此，与组织学活检相比，嗅觉评价如嗅探棒法（Sniffin’Sticks test）似乎是一种更快速、安全的方法［22-24］。

3 消化道病理

在过去的10 a 里，人们对PD 患者胃肠系统功能障碍的认识有了显著提高。近来研究提示PD 病理可能始于肠道，提出“脑肠学说”，通过尸检和活检研究，证实了中枢神经系统之外α-synuclein 的存在［25-28］。唾液腺、胃、十二指肠等都存在α-synuclein沉积，其中食道和唾液腺是浓度最高的区域，直肠的浓度最低［25］。α-synuclein 通过胃肠道“转移”到脑组织的途径包括肠道菌群的影响、迷走神经节前轴突逆行、朊病毒传播等，涉及免疫、神经内分泌和直接神经调节等机制［26］。

3.1 唾液腺病理

3.1.1 颌下腺病理：颌下腺穿刺活检可靠、安全，可以获得足够的腺实质和神经结构来评估α-synuclein的病理，经皮穿刺颌下腺活检（特别是超声引导下）对PD 诊断具有较高的特异性，可鉴别早期和晚期PD 患者，是提高PD 临床诊断准确性的可行方法之一［29-31］。然而因取材方法限制，尽管在超声引导下进行活检，也只有50%活检者能够获取到颌下腺组织。

3.1.2 小唾液腺病理：小唾液腺活检表浅、微创、容易获得，与颌下腺活检相比，并发症少，更易被患者接受。近年来，研究发现唇腺中的α-synuclein异常聚集与脑内多巴胺转运体-正电子发射型计算机断层显像（dopamine transporter positron emission tomography，DAT-PET）有很好的一致性，但仍需大样本活检来进一步验证［32-33］。在PD 早期，小唾液腺活检中能够发现硝化α-synuclein（Nitrated alpha-synuclein），这也有望作为PD诊断的生物标志物之一［34］。相对于小唾液腺活检，唾液腺活检虽取材方便，但α-synuclein 敏感性仅为67%。因此，与颌下腺和唾液腺活检相比，皮肤活检可能更容易进行、有更好的耐受性，并有更大的机会检测到α-synuclein［35］。

3.2 胃肠道病理α-synuclein 在PD 症状出现前就已经存在于胃肠道神经系统中，但α-synuclein 表达改变与PD发生关系尚不清楚，胃肠道黏膜活检可以作为PD 早期诊断的潜在工具［36-37］，但尚存在争议。早期胃肠道α-synuclein 检测研究报告的高灵敏度和特异性，并没有在随后的研究中被重复验证。通过IHC 检测胃肠道α-synuclein 沉积的诊断价值仍旧有限。

为了进一步研究胃肠道α-synuclein的表达对PD的诊断价值，RUFFMANN 等［38］用了三种技术来检测α-synuclein 的不同构象：免疫组织化学法，用总α-synuclein、磷酸化α-synuclein 和寡聚α-synuclein 抗体标记；α-synuclein 邻近连接技术（α-synuclein proximity ligation assay，AS-PLA）特异性检测寡聚α-synuclein；石蜡包埋组织印迹法（paraffin-embedded tissue blot，PET-blot）检 测 纤 维 型 和 突 触 型α-synuclein，结果发现三种检测方法的一致性低，均不能将PD患者与正常对照区分开来。另有研究显示活检标本磷酸化α-synuclein 免疫染色阳性率低（结肠、直肠阳性率低于胃），与手术标本不一致［39］。肠内磷酸化α-synuclein 沉积物的存在与肠段受损程度及PD自主神经功能障碍无关［40］。所以，通过胃肠道活检检测α-synuclein变异构象的方法似乎也不可靠。

4 周围神经病理

研究［41］显示30%～85%的PD 患者存在疼痛、麻木、感觉异常等感觉神经病变症状。有研究在PD患者腓肠神经的雪旺氏细胞胞浆中发现磷酸化α-synuclein沉积阳性率高达100%，其敏感性和特异性都非常高，并在没有临床感觉异常PD患者中的腓肠神经中也发现了丰富的磷酸化α-synuclein 表达。在腓肠神经中，磷酸化α-synuclein 沉积可能来源于雪旺氏细胞，发生于PD 临床前期，与中枢神经的多巴胺神经元与神经胶质细胞的α-synuclein 沉积类型相似［42］。因此，对于PD 早期患者，可以通过腓肠神经磷酸化α-synuclein 检测协助诊断。然而由于缺乏其他类型的神经退行性疾病作为对照，腓肠神经活检对PD鉴别诊断特异性还有待充分验证，并且腓肠神经活检为有创操作，在较长时间内造成腓肠神经分布区的感觉异常，很难作为PD常规筛查或早期诊断方法。

5 总结

PD 的明确诊断依靠病理上发现路易小体的形成和黑质致密部多巴胺神经元缺失，并有PD临床症状，但这一金标准仅在患者死亡后方能确定，功能影像并不能替代传统病理对α-synuclein 沉积程度的评判。目前，PD 的诊断依赖于某些临床特征的出现，缺乏有效的辅助检查方法及生物标志物，近年来人们在外周组织中发现α-synuclein 病理性沉积，外周病理学检查对寻找准确可靠的PD 早期生物标志物及临床前诊断可提供一定的依据。通过免疫组织化学染色皮肤真皮组织自主神经中的磷酸化α-synuclein，有助于帕金森的早期诊断，更适用于临床应用。嗅黏膜、嗅球、胃肠道的诊断性具有争议。颌下腺活检可能是提高PD 临床诊断准确性的可行方法。腓肠神经虽然阳性率、特异性及敏感性高，但神经活检是有创检查，且对于没有感觉障碍的PD患者很难接受该检查，不能常规开展。临床工作及研究中，需要根据PD患者的病程和受累的组织以及耐受性，采取适当的活检部位，进行α-synuclein或磷酸化α-synuclein免疫组织化学染色来观察异常沉积，协助PD的诊断和评估。