中性粒细胞胞外诱捕网在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的研究进展

姚倩 张小慧 胡耀嘉 金建君 刘淑媚 张燕 综述 席亚明 审校

作者单位：兰州大学第一临床医学院，兰州大学第一医院血液科（兰州市730000）

中性粒细胞是免疫系统中抵御病原体的第一道防线，也是对内源性刺激物作出的第一反应者，除吞噬和脱颗粒作用外，中性粒细胞激活后形成一种特殊的结构-中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）。正常情况下，NETs 作为宿主的防御机制；NETs 过度激活时，在非感染性疾病中也发挥着关键作用，如自身免疫性疾病、糖尿病、动脉粥样硬化，血管炎等[1]。该研究还报道，NETs 还与恶性肿瘤进展、转移及预后密切相关，发挥抗肿瘤或促肿瘤活性，也可将NETs 作为一种有用的预后生物标志物及潜在的治疗靶点。

1 NETs的结构及形成

2004年，由Brinkmann 等[2]提出，当病原体入侵时，中性粒细胞激活后形成一种特殊网状结构—NETs。该结构主要由DNA 为骨架，多种活性蛋白镶嵌其中，包括组蛋白、基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）-9、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、组织蛋白酶 G（cathepsin G，CG）等[2-3]。在电镜下，NETs 是一种超微网状结构，其骨架直径为15～17 nm，周围包绕的颗粒蛋白直径约为50 nm。该骨架能捕获病原体，而活性蛋白则杀灭病原体[4]。

NETs 可由多种物质如佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）、细菌、真菌、活化的血小板等刺激产生，此过程称为NETosis，且认为是一种特殊的死亡程序，与中性粒细胞的凋亡及坏死不同[5]。NETosis 主要有两种形式：1）是细胞溶解性，较为缓慢，需3～4 h，表现为中性粒细胞受刺激后，其细胞核经过变形、染色质疏松化导致核分裂、细胞膜破裂，NETs 随之释放到细胞外[5]；2）认为NETs 可自发性的产生，独特且迅速，中性粒细胞则可通过囊泡运输的形式分泌核染色质，同时通过脱颗粒将颗粒蛋白释放到胞外，释放的可核染色质和颗粒蛋白在胞外聚集，而中性粒细胞虽无核，但仍保持着细胞膜的完整性，并持续发挥吞噬病原微生物的作用[6]。

NETs的形成与活性氧（reactive oxygen species,ROS）和肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（peptidylarginine deimnase 4,PAD4）的调节密切相关。中性粒细胞受到 PMA 刺激后活化，通过NADPH 氧化产生ROS，使得中性粒细胞核膜破裂，从而释放出多种NETs的组成成分[7]。同时，细胞内的NE和MPO 向细胞核迁移，促进染色质的解螺旋；而PAD4 则催化组蛋白瓜氨酸化[8]，进一步使得染色质解螺旋；最后疏松化的染色质与胞质内的各种蛋白相融合，然后释放到细胞外，形成特殊的网状结构，即NETs[9]。受刺激的中性粒细胞中NADPH 氧化酶能产生杀死微生物所需的活性氧，以及在完整中性粒细胞终止其功能后诱导杀菌NETs的形成。在慢性肉芽肿病患者NADPH 氧化酶缺陷，无生成ROS的能力，故无法形成NETs[10]。

2 NETs 与弥漫性大B细胞淋巴瘤的关系

弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常见的侵袭性恶性淋巴瘤，具有很强异质性，占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%，发病率随年龄的增长而增加，DLBCL 对免疫化疗敏感，可治愈。但仍有超过30%的患者在一线免疫化疗后出现复发或转为难治性[11]。有研究表明，无论是在动物模型中还是癌症患者中，NETs 都参与了肿瘤的进展和转移；此外，NETs 还可以捕捉循环中的癌细胞，唤醒处于休眠状态的癌细胞，导致肿瘤复发和转移。Nie 等[12]研究证明，NETs在DLBCL 中亦有相同作用，能促进DLBCL 细胞的增殖、转移，影响DLBCL的预后[1]。

2.1 NETs 促进DLBCL 增殖、转移

NETs 中的多种组分（MMP-9、NE、DNA 骨架等）与恶性肿瘤的增殖、转移过程密切相关。在肺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌等小鼠模型组织中，NETs呈现出高表达状态，而在这些疾病中，中性粒细胞释放NETs的能力较强[13]。与之类似，在晚期DLBCL患者中，NETs 水平也是升高状态[12]。Mondal 等[14]研究发现，MMP-9 不仅能降解和重塑细胞外基质，促进伤口愈合及血管生成，还能促进恶性肿瘤的增殖、扩散及转移。MMP-9 能通过刺激血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）激活血管，促进血管生成，从而导致胰腺癌的转移。Demers 等[15]研究发现，在小鼠Lewis 肺癌模型中，敲除PAD4 能抑制NETs的形成，而敲除PAD4的小鼠肿瘤生长较对照组缓慢。Miller-Ocuin 等[16]研究发现，NETs 来源的胞外DNA 亦能激活胰腺星状细胞，促进胰腺肿瘤的增殖。

Nie 等[12]研究发现，用与PMA 相匹配的中性粒细胞培养液处理人和小鼠的DLBCL 细胞系，96 h 后，人与小鼠的DLBCL 细胞系的肿瘤发生了增殖，当用DNaseI 降解NETs 后，人与小鼠的DLBCL 细胞系肿瘤增殖减缓；而NE 抑制剂，通过阻止NE 核转位和染色质解缩来抑制NETosis[12，17]可获得同样的结果。该模型中，一定量的PMA 能有效的诱导增殖诱导配体（a proliferation-inducing ligand，APRIL）的分泌，该配体则由中性粒细胞分泌，并能有效的诱导肿瘤细胞的增殖[12]。该结果提示，NETs 则可在体外独立促进DLBCL的增殖和迁移。与此同时，该研究还发现，淋巴瘤来源的IL-8 及其小鼠同系物都能够诱导NETs，且通过激活Toll 样受体9（Toll-like receptors 9，TLR9）及TLR9 依赖的下游通路（NFkB、MAPK/p38和STAT3）促进肿瘤进展[12，18]。在培养体系中加入DNase I、TLR9 拮抗剂后，该通路明显受限；同时TLR9 表达下降，使得肿瘤生长缓慢，而基因敲除TLR9 也可抑制DLBCL的生长和淋巴结的转移[12]。该研究还发现，IL-8 还可以与G 蛋白偶联的趋化因子受体CXCR1和CXCR2 结合，与CXCR2 结合更紧密，导致NETs 进一步释放，体内抑制剂CXCR2 则可减少NETs的形成，从而导致肿瘤生长变得缓慢。

2.2 NETs 促进自身免疫向淋巴瘤转化

血液循环系统中NETs的产生与清除处于动态平衡，NETs 清除延迟会对自身免疫产生影响。在某些情况下，循环中NETs的持续存在，能被TLR9 识别并呈现给B 细胞，导致NETs 被激活为一种免疫反应[19]。而淋巴瘤起源于自身免疫、感染或炎症等背景下，免疫系统的失调是自身免疫和淋巴增生性疾病的一个常见原因。有研究发现，当基质细胞蛋白过度表达，与Fas 突变相关的自身免疫在缺少富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein,acidic and rich in cysteine,SPARC）时能向淋巴瘤转变，而SPARC的缺失使NETs 与CD5+B 细胞发生异常相互作用，使得CD5+B 细胞发生恶性转化，促进淋巴瘤的发生[20]。

2.3 NETs 与DLCBL 预后

Nie 等[12]分析了233例DLBCL 患者，对其肿瘤组织进行免疫荧光染色，通过单因素、多因素分析，发现晚期DLBCL 患者NETs 水平比早期DLCBL 患者水平高，而高水平NETs 与较差的总生存率（overall survival，OS）和无进展生存率（progression-free survival，PFS）有关，是OS 与PFS的独立预测因子；即NETs 水平越高，提示DLBCL 患者预后越差。血浆中游离的DNA（cell-free DNA,cfDNA）主要来源于NETs，由激活的中性粒细胞释放出来。研究表明，cf-DNA的含量在肿瘤患者中较高，可由正常细胞或凋亡的肿瘤细胞释放，也可由坏死的肿瘤细胞释放或肿瘤细胞主动分泌[21]。研究发现，通过检测cfDNA，能对DLBCL 进行实时的监测，也能快速检测DLBCL 对常规治疗的耐药性；同时，cfDNA 高负荷提示DLBCL的不良预后，能为评估肿瘤负担、确定基因突变特征及基因分类提供新的来源[21-22]。而cfDNA 作为NETs的标志物，通过有效的检测方法识别NETs，将有助于肿瘤的早期筛查、治疗检测及预后的判断。

目前，国际预后指数（international prognostic index，IPI）、美国国家癌症网络（National Comprehensive Cancer Network IPI，NCCN-IPI）、正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）技术、循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）、cfDNA 等用于评价淋巴瘤的预后，对患者结果的准确预测将有助于个体化治疗。然而，传统的风险化分层和个体化治疗选择方法是有限的。如IPI和NCCN-IPI 作为DLBCL 中广泛的预后因素模型，在临床上共同的缺点是无法识别生存率较低的患者[23]。此外，PET / CT 技术扫描代谢成像会出现假阴性或假阳性的结果，而对于低代谢活性的淋巴瘤，PET/CT 很难检测出来[24]。ctDNA 则主要用于评价微小病灶残留（minimal residual disease，MRD）[25]，但ctDNA 已被证实是侵袭性淋巴瘤预后的独立指标，广泛适用于DLBCL和潜在的其他淋巴瘤患者，有助于个体化治疗[26-27]。Kurtz 等[27]研究表明，治疗前的ctDNA 水平和分子反应，无论是在诊断还是复发，都是DLBCL的独立预后标志物，有可能指导未来的个性化风险导向治疗。而cfDNA 目前作为一线治疗期间的预后生物标志物能补充IPI、PET/CT 等的不足，也可能有助于DLBCL的诊断[22，28]。此外，肿瘤来源的cfDNA 与致癌病毒一样，进入脆弱器官的细胞，能将其转化并形成转移淋巴结，cfDNA 作为肿瘤转化的媒介和NETs的主要成分，在肿瘤中发挥重要作用[29]。总之，NETs 既能反映DLBCL的预后，还有望成为DLBCL的预后生物标志物。

3 结语与展望

近年来，NETs 已成为研究热点，值得关注的是其在恶性肿瘤发生、转移及预后等方面的作用。NETs可促进DLBCL的增殖与转移，且预后差。在DLBCL 动物模型中，已初步证明，使用DNase I、NEI 或阻断CXCR2 或TLR9 能抑制DLBCL的进展。因此，深入探究NETs 及其抑制剂在DLBCL 中的作用，但NETs 能否成为DLBCL 潜在的治疗新靶点及预后生物标记物，仍需大量前瞻性研究进行验证。