地塞米松对炎症环境下RAW264.7-L929共培养体系的影响

陈远洋 陈晓珊 周全红

伤口愈合是一个由多种细胞及细胞因子精密调控的过程，该过程包括四个连续且重叠的阶段：止血阶段、防御/炎症阶段、增殖阶段以及成熟阶段[1,2]。有效的愈合需要细胞及细胞因子有序地发挥作用，而干扰因素，如机体持续的炎症状态、免疫系统紊乱等，会使愈合过程中炎症阶段的启动或过渡受阻，导致病理性伤口的产生[3～5]。病理性伤口会加重患者的病情，降低患者生活质量，给社会及家庭带来了巨大的经济负担[6,7]。

良好的伤口愈合建立在伤口环境的稳态之上，而炎症的平衡对其稳态的维持尤为重要[4,5]。巨噬细胞对伤口愈合炎症阶段的始动和消解有重要意义，伤口愈合炎症期，巨噬细胞表达iNOS、IL-6等细胞因子，促进炎症的发生；伤口愈合增殖阶段，巨噬细胞分泌IL-10、VEGF等细胞因子，缓解炎症并促进组织修复[4]。

成纤维细胞参与伤口愈合的关键过程，如分解纤维蛋白凝块、产生新的细胞外基质等。具有迁移能力的成纤维细胞是伤口愈合顺利进行和皮肤结构完整性的重要保证[8,9]。

地塞米松以其在围术期抗炎、镇痛、减少术中恶心和呕吐的发生率等多种优势被广泛使用[11]。但关于地塞米松对持续炎症中伤口愈合的影响及机制鲜见研究。本研究拟采用Raw264.7-L929共培养体系，聚焦炎症环境下，同一体系中，地塞米松对于两种细胞主要功能的影响，为地塞米松对持续炎症下伤口愈合的影响提供新的见解与理论证据。

材料与方法

1.材料与试剂：小鼠Raw264.7巨噬细胞株、小鼠L929成纤维细胞株购自中国科学院细胞库(上海)。DMEM高糖培养基购自美国Hyclone 公司。胎牛血清购自美国Gibco公司。LPS (O55:B5)与地塞米松均购自美国Sigma公司。Transwell共培养小室购自美国Corning公司。CCK-8试剂购自日本同仁公司。RNA提取试剂盒购自南京诺维赞生物公司。反转录试剂与SYBR Green试剂盒购自武汉爱博泰克公司。

2.细胞培养：将小鼠Raw264.7细胞与小鼠L929细胞株培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，并置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，每隔1天换一次液。

3.CCK-8细胞存活率检测与实验浓度筛选：收集生长于对数期的Raw264.7细胞与L929细胞，用DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度，分别接种于96孔板中(2×104个/孔，每孔100μl)，边缘用无菌磷酸盐缓冲液填充，同时设置空白孔(无细胞，仅含培养基)、对照孔(相应细胞，仅含培养基)、实验孔(含相应细胞、相应药物浓度的培养基)，每组设置3个复孔，按以下分组处理：(1)CCK-8测地塞米松对细胞存活率的影响：使用10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L的地塞米松处理细胞24h。(2)CCK-8 测LPS与地塞米松对细胞存活率的影响：浓度为100ng/ml的LPS与不同浓度的地塞米松(0、10-8、10-7、10-6mol/L)共同处理细胞24h。之后，向每孔加入10μl CCK-8试剂，2h后在酶标仪450nm处测量各孔的吸光度(A)值，每组取3个复孔的平均值，存活率(%)=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。

4.共培养实验：取常规培养对数期生长的Raw264.7细胞和L929细胞，分别以2×105个/孔与6×105个/孔的数量接种于Transwell小室和6孔板中，在培养箱中单独培养24h后，将常规培养基更换为无血清的培养基，并将小室置于6孔板内进行共培养。

5.实验分组：基于共培养体系而进行的实验被分为5组：对照组(用“-”表示)：仅加入无血清培养基；LPS组：100ng/ml LPS处理24h；DEX组：10-7mol/L地塞米松处理24h；LPS+DEX组：100ng/ml LPS预处理6h后，100ng/ml LPS与10-7mol/L地塞米松共处理至24h；DEX+LPS组：10-7mol/L地塞米松预处理6h后，100ng/ml LPS与10-7mol/L地塞米松共处理至24h。

6.反转录PCR(RT-PCR)检测：提取各组Raw264.7细胞的总RNA，反转录得到cDNA。操作过程均按照试剂说明书进行。以GAPDH为内参，进行RT-PCR定量测试，检测各组细胞中iNOS、IL-6、IL-10 mRNA的表达。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

本实验引物设计参照文献[10]，反应条件为：95℃预变性3min； 循环反应：95℃ 5s、60℃ 30s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算相对mRNA的表达。

7.划痕实验：接种L929细胞于6孔板中，在建立共培养体系之前，用100μl的枪头垂直划痕，用显微镜拍照记录0时刻划痕处面积，然后将Raw264.7与L929细胞进行共培养。显微镜观察并记录24h后同一视野下愈合面积，计算平均愈合率。愈合率(%)=(0时刻划痕面积-24h划痕面积)/0时刻划痕面积×100%。

结 果

1.LPS与地塞米松对Raw264.7和L929细胞存活率的影响：所选浓度地塞米松对Raw264.7 细胞存活率影响较小，只有在浓度达10-3mol/L(存活率为68.75%±7.65%)时，才显著降低细胞存活率。而对于L929细胞，地塞米松浓度在达到10-7mol/L(存活率为89.67%±1.14%)后，细胞存活率开始逐步降低。综合图1中A、B的结果选取10-8、10-7和10-6mol/L的地塞米松作为后续实验浓度。图1中C、D，浓度为10-7mol/L的地塞米松与100ng/ml的处理组合在所测试的浓度中使两种细胞的存活率下降最少： Raw264.7，细胞存活率为98.01%±2.45%； L929，细胞存活率为92.12%±1.79%。后续的实验选取此种组合作为实验浓度。

图1 脂多糖与不同浓度地塞米松对RAW264.7和L929细胞存活率的影响

2.脂多糖与地塞米松对共培养体系中Raw264.7炎性细胞因子mRNA 相对表达量的影响：与对照组比较，LPS组中 RAW264.7细胞表达的IL-6和iNOS mRNA显著增加(P均<0.05)，说明细胞炎症模型建立成功(图2 中A、B)。LPS+DEX组，与LPS组比较，表达的促炎性细胞因子IL-6和iNOS mRNA有所下降(P<0.05，图2 中A、B)。而DEX+LPS组，促炎性细胞因子mRNA较LPS+DEX组更高。该结果显示，地塞米松对共培养体系中RAW264.7促炎性细胞因子mRNA的表达的影响与加药次序有关。另一方面，各组中小鼠RAW264.7细胞IL-10 mRNA的表达与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05, 图2C)。

图2 LPS与地塞米松对共培养体系中Raw264.7炎性细胞因子mRNA 相对表达量的影响

3.LPS与地塞米松对共培养体系中L929细胞迁移的影响：持续炎症下，地塞米松的处理有利于共培养体系中L929 的迁移，其迁移率远高于其他各组(P<0.05)。而地塞米松预处理后，再伴随发生的持续炎症组中的L929细胞迁移率低于LPS+DEX组(图3B,P<0.05)。地塞米松单独处理抑制了L929细胞的迁移，其迁移率明显低于对照组(P<0.05,图3)。

图3 共培养体系中L929细胞的迁移情况

讨 论

地塞米松因其强效的抗炎作用在围术期被广泛使用，但其在已有全身炎性反应的患者中对伤口愈合的作用和机制还缺乏相关研究[11]。在伤口愈合过程中，巨噬细胞具有炎症始动和消解炎症的双重功能[4]。成纤维细胞因其产生细胞外基质、修复组织等功能在伤口愈合的过程中扮演着不可替代的角色[12,13]。所以在同一体系中研究地塞米松对这两种细胞的影响有利于揭开地塞米松在持续炎症中对伤口愈合影响的谜题。

笔者建立了小鼠RAW264.7-L929细胞的共培养体系，并采用CCK-8筛选出对两种细胞存活率都影响较小的LPS与地塞米松的浓度作为实验浓度。共培养体系的建立，聚焦了地塞米松对细胞主要功能的影响，突出了研究的重点。LPS诱导RAW264.7细胞炎性反应作为体外持续炎性反应情况的模拟已被应用于诸多国内外研究中，是本研究中细胞炎症模型建立的依据[14～16]。

本研究发现，LPS可显著提高RAW264.7巨噬细胞对促炎性细胞因子mRNA的表达，这与既往文献结果一致[14,17]。地塞米松可减轻共培养体系中LPS诱导的炎性反应，表现在地塞米松降低了RAW264.7细胞对促炎性细胞因子IL-6和iNOS mRNA的表达[17,18]。而在预先使用地塞米松处理的细胞中，炎性细胞因子mRNA的表达则未被有效抑制。结果提示，地塞米松可能更有利于持续炎症状态下伤口中炎症的解决。更令人兴奋的是，研究发现了地塞米松对炎症环境下共培养体系中成纤维细胞迁移的促进作用。当地塞米松加入先于炎症发生时，其并未表现出对成纤维细胞迁移的影响。

本研究存在以下不足：(1)研究建立的共培养体系考虑到了两种细胞的相互影响，并对所产生的现象进行了阐述，但却未探讨这种影响是受何种机制控制。(2)由于共培养体系始终无法对体内复杂的情况做出充分地模拟，研究结果还需要在动物模型上进行验证。

综上所述，本研究证明了地塞米松在持续炎症的环境下有利于炎症的控制和成纤维细胞的迁移。而预先使用的地塞米松，不利于炎症控制也无助于成纤维细胞的迁移。该结论为地塞米松影响炎症下伤口愈合过程的讨论提供了细胞层面上的新思路。而地塞米松对于持续炎性反应下机体及伤口愈合的影响可能涉及到其他细胞以及相关细胞因子，其机制仍有待于进一步探讨。