白细胞介素33对心肌梗死后巨核细胞增殖、生成血小板的影响

付雯雯 吴嘉贺 胡笑容 江 洪

心肌梗死(myocardial infarction, MI)是冠心病中最严重的一种类型，具有高发生率和高致死率。医疗救治水平的提高使首次心肌梗死后生存率达到90%以上。然而，心肌梗死的复发率仍居高不下，第1年内复发率高达17.4%[1]。多项临床研究发现，心肌梗死的复发与患者新生血小板计数增加密切相关。血小板内富含各种炎性细胞因子、血小板源性生长因子和血栓素。血小板被激活后通过释放这些活性颗粒，促进炎性细胞向动脉粥样硬化斑块内浸润、迁移和增殖，加重动脉粥样斑块炎性反应，甚至导致斑块破裂，从而导致心肌梗死复发[2]。追寻血小板计数增加的机制发现，心肌梗死后骨髓巨核祖细胞数量、巨核细胞数量和成熟度均增加，形成血小板前体数量增多，而且巨核细胞在空间分布上更贴近血管内皮[3]。这些结果提示，巨核细胞增殖、发育以及生成血小板计数增加。进一步探索干预心肌梗死后骨髓巨核细胞增殖发育以及血小板过度生成的机制对于改善心肌梗死预后具有重要意义。

白细胞介素33(interleukin-33, IL-33)是属于IL-1家族的一种炎性细胞因子，主要表达于人类血管内皮细胞，以及胃肠道和肺气道上皮细胞。IL-33在心肌细胞中亦有表达。有研究表明，IL-33对动脉粥样硬化有保护作用。额外给予IL-33，可延缓ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化进展，体现在冠状动脉管腔狭窄的严重程度有所减轻，以及保护性炎性细胞因子释放增加，包括IL-4、IL-5和IL-13[4]。另外，IL-33对心肌梗死早期炎性反应也有减轻作用。但另有研究表明，IL-33信号可能具有有害作用。急性心肌梗死后，心脏组织IL-33水平升高。心肌梗死小鼠接受IL-33注射后，出现心脏功能恶化、心室重塑加重等不良结果。同时，IL-33还导致小鼠心肌梗死面积增加，加重心肌细胞死亡以及心脏破裂致死率[5]。而心肌梗死后的巨核细胞增殖与血小板过度生成可加重心肌梗死预后[3,6,7]。关于IL-33是否影响心肌梗死后巨核细胞增殖以及生成血小板，目前尚不清楚。本研究旨在探讨IL-33对心肌梗死后骨髓巨核细胞增殖、生成血小板的影响。

材料与方法

1.实验动物：SPF级C57BL6雄性小鼠，9～11周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006]。所有小鼠饲养于SPF环境中，保证饮食、清洁。实验过程严格按照武汉大学以及武汉大学人民医院动物实验规章制度执行。

2.抗体与试剂：CD41-FITC抗体、VE-Cadherin抗体购自美国eBioscience公司，CD42-APC抗体购自美国Biolegend公司。IL-33蛋白购自英国Abcam公司。血小板生成素(thrombopoietin,TPO) ELISA试剂盒购自美国R&D Systems公司。

3.心肌梗死模型的建立： C57BL6小鼠经3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，后背位固定，气管插管连接小动物呼吸机，频率120次/分钟，潮气量150μl。连接多导仪，持续记录心电图、心率变化。紧靠胸骨正中于左侧第4肋间打开胸腔，暴露心脏，剪开心包膜，于左心耳与肺动脉圆锥中点至心尖连线中上1/3处用穿有8-0缝合线的弯针勾绕并结扎冠状动脉左前降支(left anterior descending,LAD)，造成心肌梗死，以心电图Ⅱ导联ST段抬高以及心肌表面局部由红润变成发绀，则心肌梗死模型成功。逐层缝合胸腔，麻醉复苏。

4.IL-33蛋白预处理：IL-33处理组小鼠经腹腔注射IL-33蛋白(50μg/kg)连续14天，对照组小鼠腹腔注射同等剂量磷酸盐缓冲盐水(PBS)连续14天。然后两组小鼠分别进行心肌梗死造模。

5.骨髓免疫荧光染色：3%戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠后，颈椎脱臼处死小鼠，取股骨经4%多聚甲醛浸泡固定后，液氮冻存。冷冻切片机切割直至骨髓充分暴露，室温放置片刻后取出骨组织，进行免疫荧光染色。分别使用CD41-FITC与CD42-APC孵育标记。染色完毕后，用高分辨率共聚焦荧光显微镜进行成像，统计图像中巨核细胞数量以及生成的血小板前体数量。CD41+CD42+标记成熟巨核细胞，CD41+CD42-标记未成熟巨核细胞。

6.流式细胞术：分离提取小鼠原代骨髓细胞，加入CD41-FITC (5微升/106个细胞)与CD42-APC(5微升/106个细胞)孵育30min后，洗去抗体。采用美国BD公司流式细胞仪检测CD41+CD42+细胞与CD41+CD42-细胞数量，Flowjo软件分析数据。

7.血小板计数：经小鼠尾静脉抽取50～70μl经ETDA抗凝血，用全血细胞计数仪检测血小板计数。

结 果

1.IL-33处理对MI小鼠循环血液中血小板计数的影响：心肌梗死造模1天和3天后，IL-33处理组小鼠的血小板计数与对照组比较，差异无统计学意义，这提示IL-33对心肌梗死后血小板生成无显著影响(图1)。

图1 IL-33处理对心肌梗死小鼠血小板计数的影响

2.IL-33处理对MI小鼠骨髓巨核细胞的影响：心肌梗死造模3天后，免疫荧光染色检测IL-33处理组小鼠骨髓成熟巨核细胞(CD41+CD42+)与未成熟巨核细胞(CD41+CD42-)数量均高于对照组。同样的，采用流式细胞术检测也发现IL-33处理组小鼠骨髓成熟巨核细胞与未成熟巨核细胞占全骨髓细胞的比例升高，这提示IL-33处理使心肌梗死后骨髓内巨核细胞增多(图2中A～F)。

3.IL-33处理对MI小鼠骨髓中血小板前体(proplatelet)的影响：心肌梗死造模3天后，采用免疫荧光染色发现，IL-33处理组小鼠骨髓巨核细胞生成的血小板前体数量与对照组比较未见明显变化。血小板前体为巨核细胞胞质延长的伪足样结构，伸入血管窦，末端脱落形成血小板，因此可代表巨核细胞生成血小板能力。这一结果进一步提示IL-33不影响心肌梗死后的血小板生成(图2G)。

图2 IL-33处理对心肌梗死小鼠成熟巨核细胞和未成熟巨核细胞的影响

4.IL-33处理对MI小鼠血清TPO水平的影响：TPO是目前已知最强效的促巨核系增殖与血小板生成的因子[8]。笔者采用ELISA检测小鼠血清TPO水平，发现IL-33处理组与对照组差异无统计学意义，这提示IL-33不影响小鼠血清TPO水平(图3)。

图3 IL-33处理对心肌梗死小鼠血清TPO水平的影响

讨 论

IL-33是一种介导免疫应答的炎性细胞因子，在炎症、感染等刺激下，IL-33作为一种内源性危险信号，在细胞损伤或坏死后释放，促进免疫细胞的募集以及组织修复，在机体固有免疫与适应性免疫中发挥重要作用[9～12]。除了诱导促炎性反应外，IL-33还通过启动Th2型免疫反应在同种异体移植物存活期间发挥关键作用，以及促进中性粒细胞募集和吞噬以对抗严重脓毒症[13]。IL-33的受体是ST2(suppression of tumorigenicity 2)。IL-33通过与ST2受体结合，进而与IL-1受体辅助蛋白结合，激活包括MYD88、IRAK1、IRAK4、TRAF6在内的信号蛋白复合物形成，从而激活NF-κB和有丝分裂原活化蛋白激酶(ERK、p38和JNK)等信号通路，诱导免疫细胞的增殖、存活、迁移，并促进IL-4、IL-5和IL-13等炎性细胞因子以及一些趋化因子的释放[14, 15]。心肌梗死后，一系列免疫细胞以及免疫因子被激活，其中包括IL-33，其在心肌梗死后表达升高[5]。关于IL-33对心肌梗死预后有利还是有害，目前尚有争议。体外给予IL-33可延缓ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化进展，表明IL-33对心血管疾病有保护作用。但也有研究发现，IL-33可致心肌梗死小鼠心脏功能恶化。

因血小板在动脉粥样硬化发生、发展过程中起重要作用，本研究从另一个角度出发，探讨IL-33对血小板生成的作用。血小板由巨核细胞产生。近年来研究发现，IL-33可以调控巨核细胞的免疫分化，使巨核细胞具有类似免疫调节细胞的表型[16]。然而尚无研究表明，IL-33是否可以影响巨核细胞增殖、分化与血小板生成。既往的研究结果也未发现IL-33有直接促进MK生成血小板的作用。本研究发现，IL-33使心肌梗死小鼠骨髓内巨核细胞与巨核祖细胞的数量增多，但血小板计数无明显变化，TPO水平也无改变。这提示IL-33可能通过不依赖TPO的途径促进心肌梗死后骨髓巨核细胞增殖，但不影响血小板生成。

因时间、材料有限，本研究暂未进一步探讨IL-33促进巨核细胞增殖的机制。有研究发现，IL-33受体ST2表达于造血干、祖细胞表面[17,18]。ST2-/-小鼠与野生型小鼠比较，其骨髓中，粒系-巨噬系、红系和多潜能祖细胞数量都有所减少，同时，这些细胞的增殖能力也有所降低，这提示IL-33/ST2有促进骨髓造血干、祖细胞增殖的作用[18]。本研究发现，IL-33对心肌梗死小鼠巨核细胞增殖有促进作用，与既往研究结果相符合。在哮喘患者中，IL-33可诱导骨髓来源的CD34+造血祖细胞向基质衍生因子-1α(stromal derived factor-1α, SDF-1α)梯度迁移[19]。因此，IL-33也可能通过促进造血干、祖细胞迁移至SDF-1α高浓度的血管龛周围，从而促进巨核细胞增殖与分化，使巨核细胞数量增多。

综上所述，本研究发现IL-33可促进心肌梗死后小鼠骨髓中巨核细胞增殖，但不影响其生成血小板，对于深入理解心肌梗死后IL-33对骨髓造血系统产生的影响具有一定意义。心肌梗死后血小板的过度生成是造成心肌梗死不良预后的重要原因之一[20]。因此，本研究结果提示，IL-33可能不通过干扰血小板生成来影响心肌梗死预后。