8种别样茶对AGEs抑制能力的筛选及其抑制机制探究

陈春宇，张佳琪，李依萍，米 娜，李 丽，易 帆,

（1.北京工商大学化学与材料工程学院，北京市植物资源研究开发重点实验室，北京 100048；2.北京工商大学，中国轻工业化妆品重点实验室，北京 100048）

非酶糖基化反应又称美拉德反应[1]，当还原糖与氨基反应生成不稳定的希夫碱（Schiff bases），继而重排形成较稳定的阿马多里（Amadori）重排产物，称早期糖化产物；阿马多里重排产物与蛋白质的氨基作用，糖基部分经脱水反应后形成不饱和醛酮化合物；醛酮化合物再与蛋白质的游离氨基作用，蛋白质因分子间或分子内交联及裂解而变性，最终生成不可逆的非酶糖基化终末产物（Advanced Glycation End Products，AGEs）[2]。

AGEs的积累与许多退行性过程或疾病的发展相关[3-4]，包括糖尿病[5]、心血管疾病[6]、神经紊乱[7]、动脉粥样硬化[8]及其并发症等，以及加重涉及氧化应激机制的病理过程和加快衰老的进程[9]。AGEs能激活受体RAGE，进而诱导并进一步促进氧化应激反应发生，同样诱导炎症级联反应发生以及促进促炎细胞因子、生长因子的表达[10]。AGEs还可以通过交联胞内外蛋白质，破坏蛋白结构、变形，最终使蛋白失去生物学特性。因此，AGEs抑制剂作为预防或减轻这些疾病的治疗药物十分具有前景。

AGEs抑制剂主要分为合成和天然两大类。化学合成抑制剂如氨基胍（AG）、吡哆胺、二甲双胍等虽然具有抑制AGEs的作用，但也伴随着肠胃功能紊乱、罕见血管炎等副作用和安全隐患[11]。因此，从食物中提取天然生物活性物质病开发成AGEs抑制剂已引起研究人员的广泛关注。研究表明，多酚类化合物是天然AGEs抑制剂的重要来源，肉桂酸及其衍生物、绿原酸、丁香酸、香草酸、鞣花酸、槲皮素、染料木素、没食子酸等重要酚类化合物有效抑制糖基化已见报道[12]。

别样茶（non-Camelliateas）在民间常作为预防及治疗疾病的药物，在部分地区和民族范围内有作茶饮用的悠久历史，有一定的安全性基础，具有作为新药研究和保健品开发的潜力[13]。有研究分析别样茶含有丰富的黄酮类、多酚类、萜类、挥发油、生物碱和有机酸类化合物，其中黄酮类、多酚类化合物在别样茶中占比最大[14]，具有较强的降糖作用和抗氧化活性。

目前在国内确认属于可食用的别样茶有20余种，我们对其中具有降血糖、降血脂和抗氧化的别样茶进行了筛选，共整理出8种。本研究以此8种别样茶（大麦茶、大叶苦丁茶、枸杞茶、甜茶、湖北海棠、连翘叶茶、青钱柳茶、小叶苦丁茶）为研究对象，通过还原日常茶饮过程的水提法对其有效成分进行提取，并检测其中总黄酮化合物含量。随后通过构建体外牛血清白蛋白-果糖反应液孵育体系，模拟体内蛋白质非酶糖基化过程检测8种别样茶抑制晚期糖基化终末产物（AGEs）生成的能力，最终对筛选出抑制AGEs活性较好的大叶苦丁茶及甜茶进一步检测其对非酶糖基化反应早期产物果糖胺、中期产物活性羰基化合物以及蛋白质交联的抑制能力。本文旨在探索别样茶抑制非酶糖基化功效，并阐明其对糖基化过程的抑制机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

8种别样茶（见表1） 分别采购于相应产区；芦丁标准品、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠 国药集团化学试剂有限公司；果糖、牛血清白蛋白 碧云天生物技术有限公司：硫酸氨基胍、叠氮化钠 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；果糖胺检测试剂盒、活性羰基化合物检测试剂盒 北京百瑞极生物科技有限公司。

表1 8种别样茶功效成分Table 1 functional ingredients of 8 non-Camellia teas

TB-2002电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；XS205分析天平 梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；XL-10B粉碎机 广州市旭朗机械设备有限公司；DW-86L388A超低温保存箱 海尔集团；VIRTIS冷冻干燥机 北京艾泽信科技公司；N-1200A旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；ILMVAC GmbH真空抽滤机 上海易晟机电科技有限公司；M200PRO多功能酶标仪，TECAN；KYC-100B恒温箱 上海福玛实验设备有限公司；QL861涡旋器 海门市其抹贝尔仪器制造公司；HWS24型水浴锅 上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 别样茶活性成分提取 将8种别样茶烘干粉碎，过50目筛备用。按料液比1:50（g/mL），称取原料4.0 g，去离子水200 mL，80 ℃下回流提取2 h，过滤。利用旋转蒸发仪将滤液真空浓缩10倍。将浓缩提取液倒入培养皿中，-80 ℃下冷冻24 h，取出，用冻干机将别样茶有效物质干燥，称重，备用。

1.2.2 黄酮含量测定 采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法进行实验，用75%乙醇将芦丁对照品溶解，制备质量浓度为1.0 g/L的芦丁溶液；用乙醇稀释得质量浓度分别为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的对照品溶液；分别取1 mL不同浓度的芦丁对照品溶液于容量瓶（10 mL）中，依次加入4 mL去离子水和0.3 mL质量分数为5%的NaNO2，摇匀；5 min后分别加入0.3 mL质量分数为10%的Al（NO3）3，摇匀；待反应6min后分别加入2 ml质量分数为1 mol/L的NaOH；加入去离子水补齐至刻度线，静置10 min后测定510 nm处吸光值，以75%乙醇作为空白对照，得标准曲线y=7.1408x+0.0039，R²=0.9979（n=6）。分别称取适量8种别样茶冻干粉溶于去离子水中，配制质量浓度为1 mg/mL的溶液，分别取出1 mL于10 mL容量瓶中，依次加入4 mL去离子水和0.3 mL质量分数为5%的NaNO2，摇匀；5 min后分别加入0.3 mL质量分数为10%的Al（NO3）3，摇匀；待反应6 min后分别加入2 mL质量分数为1 mol/L的NaOH；最后加入去离子水补齐至刻度线，静置10 min后测定510 nm处吸光值，以75%乙醇作为空白对照。黄酮得率计算如以下公式：

式中，V：水提液总体积，200 mL；y：黄酮含量测定中510 nm处的吸光度；m：提取中加入样品的质量，4000 mg。

1.2.3 体外非酶糖基化抑制试验 参考Spagnuolo等[24]的方法，配制pH为7.3～7.4的PBS溶液，并向其中加入0.02%叠氮化钠；以配制的PBS溶液为溶剂分别配制20 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）溶液和0.5 mol/L果糖溶液，前者0.45 μm水系滤膜过滤；20 mg/mL BSA溶液与0.5 mol/L果糖溶液1:1混匀得BSA-果糖反应液备用。

用配制好的PBS稀释1.2.1中的别样茶提取物至 5000、500、50、10 μg/mL四个浓度。将受试物与反应液混合，作为样品组（A组）；将PBS与反应液混合，作为阴性对照组；以氨基胍为阳性对照物，与反应液混合作为阳性对照；受试物与PBS混合，作为空白对照。按表2给出的配比配制不同试验组作为孵育体系，于37 ℃恒温培养箱避光孵育5 d。

表2 反应体系建立Table 2 Establishment of reaction system

第5 d，每个样品设定3个平行，使用荧光酶标仪，设定激发波长370 nm和发射波长440 nm检测结果为3次测定的算数平均值，计算RSD（相对标准偏差）。3个平行测定的荧光值RSD应≤3%，有时其中一个数值偏差大，导致RSD＞3%，应适当选取另两个平行测定的算数平均值作为检测结果。并根据公式2计算抑制率（IR）：

1.2.4 果糖胺含量测定 参考Liu等[25]的方法，非酶糖基化孵育体系的建立参照“1.2.3”中“表3”所示，孵育时间调整为3 d。将10 μL糖化牛血清白蛋白与硝基四氮唑蓝NBT显色液200 μL充分混匀作为样品孔，10 μL牛血清白蛋白与2 mmlol/L N,N-二甲基甲酰胺（DMF）标准液混合作为标准孔，在37 ℃下孵育15 min，530 nm下测定OD值。

式中，1 mmol/L=1 mmol/L×分子量（249）×10-3=0.249 g/L

1.2.5 活性羰基化合物含量的检测 参考Shin等[26]的方法，试验方法参照试剂盒说明书，非酶糖基化孵育体系的建立参照1.2.4中方法，孵育时间调整为4 d。将0.125 mL样本与0.750 mL双蒸水进行混合后加入0.125 mL 2,4-二硝基苯肼（DNPH）溶液，静置5 mL，在370 nm测定吸光度值。

1.2.6 硫黄素-T分析蛋白质交联抑制率 参考吴夏青[27]的方法，配制硫黄素T（ThT）工作液，置于4 ℃避光储存待用。将10 μL待测液（“1.2.4”中的孵育体系）与200 μL ThT工作液（稀释10倍）混合，用酶标仪振荡均匀，在激发波长440 nm，发射波长482 nm下测定荧光值。

1.3 数据处理

所有实验重复3次，采用Graph Prism 9和SPSS软件整理分析数据，不同浓度的组间两两比较采用two-way ANOVA检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异高度显著，P＜0.001为差异极显著，所得结果以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 总黄酮含量

对8种别样茶总黄酮含量进行测定，表3为8种别样茶总黄酮含量及得率。结果表明：大叶苦丁茶的总黄酮含量最高，高达4.8835 mg/mL，明显高于其他7种别样茶，其余7种别样茶的提取得率都低于5.2%，黄酮含量相对较低。大麦茶中未检测出黄酮成分。

表3 8种别样茶提取物中总黄酮含量及总黄酮得率Table 3 Flavonoid content and flavonoid extraction rate in 8 non-Camellia teas

2.2 别样茶抑制非酶糖基化反应能力及与总黄酮含量的相关性分析

非酶糖基化反应又称美拉德（Millard）反应，是发生在还原糖的羰基和蛋白质游离的氨基上的一系列复杂反应，最终生成晚期糖基化终末产物（AGEs），以AGEs抑制率作为指标，研究8种别样茶抑制非酶糖基化反应能力，结果见表4。如表4所示，在最高浓度5000 μg/mL时，别样茶提取物均表现出较强烈的抑制作用，大叶苦丁茶、枸杞茶、甜茶、连翘叶茶以及青钱柳茶的提取物均表现出高于90%的抑制率，除了小叶苦丁茶外均呈现浓度依赖性。浓度降低至50 μg/mL时，大叶苦丁茶、甜茶提取物仍然保持较高的抑制率，远远高于同等浓度下的其他别样茶提取物以及阳性对照氨基胍AG，大麦茶在该浓度下没有抑制效果。即使是最低浓度10 μg/mL下，大叶苦丁茶糖基化抑制率19.26%±0.15%，甜茶抑制率15.11%±0.86%，这两种别样茶提取物仍有抑制效果，远高于同等浓度下的其余的别样茶提取物。综合考虑，大叶苦丁茶、甜茶的抑制AEGs产生的能力最强，因此选择这两种别样茶进行进一步的研究，探索它们的抑制非酶糖基化反应的机制。

表4 8种别样茶对体外非酶糖基化抑制率的影响Table 4 Influence of 8 non-Camellia teas on the inhibition rate of non-enzymatic glycosylation in vitro

总黄酮得率较高的别样茶中，大叶苦丁茶、湖北海棠茶提取物均表现出较好的抗糖基化活性，在50 μg/mL浓度下仍有较高的抑制率。而没有总黄酮含量的大麦茶提取物在50 μg/mL时对糖基化反应无抑制效果。根据结果推测黄酮类化合物含量高的别样茶相较于含量低的别样茶抑制糖基化效果更好。随后采用GraphPad Prism 9.0进行糖基化抑制率与总黄酮含量的相关性分析，未能发现明显强相关性（r=0.6493,P=0.115，95%置信区间：-0.2030～0.9418）。

2.3 别样茶对果糖胺生成的抑制作用

果糖胺是非酶糖基化早期Amadori加合物的氧化产物，是非酶糖基化反应的早期阶段的标志性产物[25]，通过测定对果糖胺的抑制率，考察2种筛选出的别样茶提取物对非酶糖基化反应早期的抑制能力。如图1所示，在50、500和5000 μg/mL的浓度下，两种别样茶对果糖胺生成的抑制率均极显著高于阳性对照氨基胍的抑制作用（P＜0.01），大叶苦丁茶和甜茶抑制果糖胺能力较强，与5000、50 μg/mL相比，在500 μg/mL浓度时大叶苦丁茶和甜茶均表现出更强的抑制效果。甜茶相对大叶苦丁茶抑制能力更强，但两者并未表现出显著的差异性。

图1 别样茶对果糖胺的抑制率Fig.1 Inhibition rate of non-Camellia teas on fructosamine

2.4 别样茶对活性羰基化合物的抑制率

非酶糖基化反应的第二阶段是羰基中间体的形成。羰基中间体是糖基化反应的标志物之一且具有高度的生理损害性，因此抑制活性羰基化合物的生成能抑制糖基化反应的发生及进程[28]。通过测定糖化反应过程中期活性羰基化合物的水平，考察2种别样茶提取物对非酶糖基化反应中期的抑制能力，结果见图2。在50、500和5000 μg/mL的浓度下，两种别样茶对蛋白质活性羰基化合物的抑制作用依然显著地高于阳性对照氨基胍的抑制作用，呈现出极其显著性差异（P＜0.001），大叶苦丁茶结果呈浓度依赖性。在高浓度（5000 μg/mL）时大叶苦丁茶的抑制能力要极显著高于甜茶（P＜0.001），而在低浓度（50 μg/mL）时甜茶的抑制能力要强于大叶苦丁茶（P＜0.01）。

图2 别样茶对活性羰基化合物的抑制率Fig.2 Inhibition rate of non-Camellia teas on protein carbonylation

2.5 别样茶提取物对蛋白质交联结构的抑制作用

牛血清蛋白被糖基化后分子内活分子间含有大量淀粉样β-交联结构，蛋白质与AGEs进行交联后会失去生物学特性，根据Tht结合交联结构后的荧光强度大小判定β-交联结构水平。如图3所示，5000 μg/mL时，氨基胍的抑制能力极显著强于两种别样茶提取物（P＜0.001），在50 μg/mL的浓度下两种别样茶表现出较好的AGEs与蛋白质交联抑制能力，极显著性强于阳性对照氨基胍（P＜0.001），且甜茶的抑制能力要极其显著强于大叶苦丁茶（P＜0.001）。

图3 别样茶提取物浓度对蛋白质交联抑制率的影响Fig.3 Effect of the concentration of non-Camellia tea extracts on the inhibition rate of protein cross-linking

3 结论

为获得抑制非酶糖基化能力强的别样茶，本研究通过模拟日常饮用状态对8种别样茶进行提取，并对其抑制AGEs生成的作用进行检测。筛选得到抑制效果较强的大叶苦丁茶和甜茶，实验表明这两种别样茶在最低浓度（10 μg/mL）下仍然发挥一定的抗糖基化能力。本研究同时检测各别样茶提取物的总黄酮含量，结果表明黄酮类化合物含量高的别样茶相较于含量低的别样茶抑制糖基化效果更好，但并未呈现出黄酮含量与其抗糖化之间的量效关系。

糖基化反应分为三个阶段，而果糖胺是早期阶段的标志性产物，活性羰基化合物是中期阶段的标志性产物。本研究筛选出大叶苦丁茶和甜茶并进一步探究其抑制非酶糖基化的机制。结果表明，2种别样茶的抑制作用都主要集中在抑制糖基化中期产物活性羰基化合物的产生，抑制率达到了90%以上。且甜茶对蛋白质交联抑制率最高，为81.41%。本研究首次报道大叶苦丁茶与甜茶具有强抑制AGEs生成的效果，并对其作用机制进行初步的探究。

AGEs的积累与许多退行性过程或疾病的发展或加重有关，包括老化、动脉粥样硬化和糖尿病等。本研究为大叶苦丁茶和广甜茶作为具有抑制非酶糖基化功效保健食品或抗糖基化功效化妆品原料提供科学理论依据。