小麦茎基腐病病原假禾谷镰刀菌与赤霉病之间的关系

江 航，祁 凯，马立国，张 博，张悦丽，马国苹，齐军山

(山东省农业科学院植物保护研究所/山东省植物病毒学重点实验室，山东济南 250100)

小麦茎基腐病(Fusarium crown rot，FCR)广泛发生于干旱与半干旱小麦种植区。该病害最早发现于上世纪50年代的澳大利亚，之后相继在美国、新西兰、加拿大、阿根廷等国家被发现并报道[1-4]。小麦茎基腐病是由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、假禾谷镰刀菌(Fusariumpseudograminearum)、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)等多种镰刀菌复合侵染引起的一种土传病害，在小麦整个生育期均可发生[5]。发病时，发病小麦茎基部逐渐变褐，湿度大时，在发病部位可见粉红色霉层，严重时可引起小麦死亡，形成白穗[6]。小麦茎基腐病不仅严重影响小麦产量，其病原菌产生的真菌毒素还能够影响小麦品质[7]。由于秸秆还田导致病原菌在土壤中积累，加之主栽品种普遍感病[8-9]，小麦茎基腐病在黄淮地区快速蔓延，已经成为小麦生产中潜在的重要病害，严重威胁中国的粮食安全。

2012年，中国首次报道由假禾谷镰刀菌引起的小麦茎基腐病[10]。此后，在山东、河南、河北、陕西、甘肃、宁夏、新疆等大部分地区，发现假禾谷镰刀菌是这些地区小麦茎基腐病的优势病原菌[11-14]。假禾谷镰刀菌不仅导致小麦茎基腐病，还能够引起小麦赤霉病，但相关报道较少。2013年，在河北省发现假禾谷镰刀菌可引起小麦赤霉病[15-16]。小麦赤霉病不仅造成小麦减产，其病原菌还能够合成危害人畜健康的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)等毒素[7]。然而由假禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病在黄淮麦区的研究较少，需要进一步的研究来明确两者之间的关系。

小麦茎基腐病和赤霉病都是小麦生产上的重要病害。其中小麦茎基腐病已成为黄淮地区小麦生产上最主要的病害，其优势病原假禾谷镰刀菌与小麦赤霉病的关系目前仍不清楚。本研究于2021年春从山东省小麦茎基腐病发生严重的田块采集病株，对病株上分离到的菌株进行鉴定，并测定这些菌株在小麦茎基部和小麦穗部的致病力；于小麦成熟期，在相同田块采集小麦赤霉病病株，对病穗进行组织分离并鉴定，以期明确假禾谷镰刀菌与小麦赤霉病之间的关系，为预防假禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 小麦发病样品采集

本试验所有小麦病株和病穗分别于2021年3月和6月采自山东省济南市商河县许商街道五里庙村，小麦品种为济麦22。

1.2 发病组织真菌的分离纯化

采用组织分离法对小麦苗期根部、茎基部和叶鞘以及小麦成株期穗部的真菌进行分离培养。具体操作：将发病部位用自来水清洗干净，在无菌环境中分别将根部、茎基部、叶鞘以及病穗组织放入70%的乙醇中消毒30 s，随后转入3%的NaClO溶液中消毒90 s，再用无菌水洗涤3遍。将消毒后的根部、茎基部、叶鞘以及小麦穗部分别转接至提前倒好的PDA培养基中，置于25 ℃培养箱中培养3～5 d。将长出的真菌纯化培养并进行单孢分离，菌株纯化后保存备用。

1.3 分离菌株鉴定

采用形态学和分子生物学两种方法对菌株进行鉴定。形态学鉴定：将分离到的所有菌株分别转接至PDA平板中，待菌落长大后，根据菌落的形态对所有菌株进行形态学鉴定。分子生物学鉴定：用牙签分别刮取不同菌株在PDA培养基上的菌丝，利用CTAB法分别提取不同菌株的基因组DNA，用引物ITS1/4[17]分别扩增所有菌株的ITS序列，PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行Blast比对分析。另外以提取的不同菌株的基因组DNA为模板，分别用禾谷镰刀菌特异性引物Fg16NF/R[18]、假禾谷镰刀菌特异性引物Fp1-1/2[19]和麦根腐平脐孺孢特异性引物COSE-F/R[20](表1)进行PCR扩增，根据扩增条带的有无和大小进行菌株鉴定。本研究中所有的PCR产物均用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

表1 本研究中使用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 病原菌对小麦茎基部致病力测定

取适量小麦种子(品种为济麦22)，用3%的NaClO溶液进行表面消毒，用无菌水冲洗3遍，然后置于铺有3层无菌滤纸的无菌培养皿中催芽3 d，催芽期间，每隔12 h用无菌水冲洗小麦种子。将待测菌株在PDA培养基上于25 ℃培养箱中活化培养3 d，然后用5 mm打孔器在菌落边缘打菌饼。借鉴套菌碟的方法测定不同菌株对小麦茎基部的致病力[21]，并对方法进行部分改进。具体方法：将菌饼贴在胚芽基部，然后用无菌纱布将菌饼与催芽3 d的胚芽卷起来，使菌饼紧贴胚芽，每块纱布卷10株小麦胚芽，每个菌株重复3次，将处理后的胚芽置于铺有3层滤纸的无菌培养皿中，以未接菌的PDA培养基作为对照。然后置于25 ℃的光照培养箱中培养(12 h黑暗，12 h光照)，培养期间，每天给培养皿中补充无菌水，7 d后调查发病情况并拍照。

1.5 病原菌对小麦穗部致病力测定

用牙签挖取在PDA培养基上活化培养3 d的待测菌株的菌块，移至CMC(羧甲基纤维素钠)培养基中，置于25 ℃，175 rpm的摇床中培养 5 d，将分生孢子的浓度调为1×105个·mL-1(对于不产孢的菌株，用菌丝接种)。选取扬花期的小麦穗(品种为济麦22)，然后将10 μL的孢子悬浮液接种于小麦穗中部偏下的小穗中，分别在小麦穗部和保鲜袋中喷水，将保鲜袋套在小麦穗上保湿2 d，每个菌株接种8个小麦穗，14 d后统计发病情况并拍照。

2 结果

2.1 小麦茎基部病菌的分离

2021年3月，山东省济南市商河县五里庙村小麦苗长势整体较弱，部分小麦还出现了死苗的现象，经初步判断为该地区暴发了小麦茎基腐病，随后在该发病严重的田块采集小麦病株，并对发病小麦根部、茎基部和叶鞘处进行组织分离和病原菌鉴定，结果共分离到21种真菌(表2)。

表2 小麦病株茎基部分离的菌株Table 2 Strains isolated from diseased wheat stem base

2.2 分离菌株的形态学鉴定结果

将分离到的菌株在PDA培养基上进行培养，可以看到，菌株CAJA211(C01)、CAJA215(C05)和CAJA218(C08)在PDA培养基上生长迅速，菌丝稠密，颜色呈白色或黄色，在培养基中易产生红色的色素(图1)；菌株CAJA212(C02)、CAJA213(C03)、CAJA214(C04)、CAJA216(C06)、CAJA217(C07)、CAJA21A(C10)、CAJA21B(C11)、CAJA21C(C12)、CAJA21D(C13)、CAJA21G(C16)、CAJA21H(C17)、CAJA21J(C18)、CAJA21L(C20)和CAJA21M(C21)在PDA培养基上也生长迅速，气生菌丝稠密，呈绒毛状，充满整个培养皿，颜色呈白色，在培养基中形成粉红色或红色的色素(图1)；菌株CAJA219(C09)、CAJA21F(C15)和CAJA21K(C19)的气生菌丝较少，菌落颜色呈深灰色，菌落边缘具有轮纹(图1)；菌株CAJA21E(C14)的气生菌丝稀疏，颜色呈白色，在培养基中形成黄色的色素。根据菌株的形态特征，初步将菌株C01、C05和C08鉴定为禾谷镰刀菌(F.graminearum)，菌株C02、C03、C04、C06、C07、C10、C11、C12、C13、C16、C17、C18、C20和C21鉴定为假禾谷镰刀菌(F.pseudograminearum)，菌株C09、C15和C19鉴定为麦根腐平脐蠕孢(Bipolarissorokiniana)。

2.3 分离菌株的分子生物学鉴定结果

对所有菌株的ITS序列分别进行Blast比对分析，发现菌株C01、C05和C08的ITS序列与禾谷镰刀菌的ITS序列相似度最高；菌株C02、C03、C04、C06、C07、C10、C11、C12、C13、C16、C17、C18、C20和C21的ITS序列与假禾谷镰刀菌的ITS序列相似度最高；菌株C09、C15和C19的ITS序列与麦根腐平脐蠕孢的ITS序列相似度最高；菌株C14的ITS序列与多生枝鼻菌(Cladorrhinumfoecundissimum)的ITS序列相似度最高(图2A)。禾谷镰刀菌特异性引物、假禾谷镰刀菌特异性引物和麦根腐平脐孺孢特异性引物的PCR扩增结果表明，菌株C01、C05和C08为禾谷镰刀菌(图2B)，菌株C02、C03、C04、C06、C07、C10、C11、C12、C13、C16、C17、C18、C20和C21为假禾谷镰刀菌(图2C)，菌株C09、C15和C19为麦根腐平脐蠕孢(图2D)。其中，假禾谷镰刀菌占比66.67%，禾谷镰刀菌和麦根腐平脐蠕孢均占 14.29%。

A：ITS引物的PCR结果；B：禾谷镰刀菌特异性引物的PCR结果；C：假禾谷镰刀菌特异性引物的PCR结果；D：麦根腐平脐蠕孢特异性引物的PCR结果。M代表DL2000，1～21分别代表菌株C01～C21(对应的菌株见表2)，CK代表阳性对照(H2O)。

2.4 分离菌株对小麦茎基部的致病性

选取禾谷镰刀菌菌株C01、C05和C08以及部分假禾谷镰刀菌菌株C03、C04、C06、C10、C11、C13、C16、C17、C20和C21共13种菌株，测定其在小麦苗期对小麦茎基部的致病力。结果表明，选取的所有菌株都能引起严重的小麦茎基腐病症状，在茎基部出现了变褐、腐烂的现象，而对照小麦茎基部无此现象出现(图3)。

CK：未接菌。 CK：Uninoculated.

2.5 分离菌株对小麦穗部的致病性

利用2.4的13个菌株，测定其对小麦穗部的致病力，结果表明，所有菌株均能引起典型的小麦赤霉病症状(图4A)。对小麦穗部接种点进行组织分离和病原菌鉴定，利用禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌特异性引物对重新分离到的真菌分别进行PCR鉴定，发现在小麦穗部分离到了与接种时相对应的菌株(即接种假禾谷镰刀菌的麦穗分离到的是假禾谷镰刀菌，接种禾谷镰刀菌的麦穗分离到的是禾谷镰刀菌)(图4B)。

A：小麦穗部接种禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌后的症状，CK代表接种无菌水；B：禾谷镰刀菌特异性引物(左)和假禾谷镰刀菌特异性引物(右)对发病穗部分离到的菌株的PCR检测结果，M代表DL2000，1～13分别代表菌株C01、C03、C04、C05、C06、C08、C10、C11、C13、C16、C17、C20和C21(对应的菌株见表2)，CK代表阴性对照(H2O)。

表3 玉米秸秆和小麦病株穗部分离的菌株Table 3 Strains isolated from corn straw and diseased wheat heads

2.6 玉米秸秆上子囊壳的鉴定

2021年3月，在小麦茎基腐病重病田块，发现部分还田的玉米秸秆上存在一些真菌的子囊壳(图5A)，挑取这些子囊壳并将其压开镜检，发现其中的子囊孢子尚未成熟(图5B)，无法直接鉴定。将压开子囊壳的水溶液涂布于PDA培养基上，次日挑选单菌落进行培养并鉴定，发现从子囊壳水溶液中分离出的菌株PMAJ211(P01)和PMAJ212(P02)分别与禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌的形态相似(图5C)；用禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌特异性引物进行进一步鉴定，发现菌株P01是禾谷镰刀菌，P02是假禾谷镰刀菌(表3和图5D)。2021年4月底，将菌株P01和P02分别接种小麦穗部，发现菌株P01和P02都能引起严重的小麦赤霉病(图5E)。

A：玉米秸秆上子囊壳的形态特征；B：子囊壳中子囊的形态特征；C：子囊壳分离菌株在PDA培养基上的表型，P01和P02对应的菌株见表3；D：禾谷镰刀菌特异性引物(左)和假禾谷镰刀菌特异性引物(右)对子囊壳分离菌株的PCR检测结果，1和2分别代表菌株P01和P02，CK代表阴性对照(H2O)；E：小麦穗部接种子囊壳分离菌株的症状。

2.7 小麦赤霉病病原的分离鉴定

2021年6月于小麦成熟期，在同一地块采集自然发生的小麦赤霉病病穗进行组织分离和病原菌鉴定，得到HAJ211(H01)～HAJ219(H09)、HAJ21A(H10)、HAJ21B(H11)和HAJ21C(H12)共12种菌株(表3)，分别对这12种菌株进行形态学(图6A)和分子生物学鉴定(图6B)，发现菌株H06和H08为假禾谷镰刀菌，占 16.67%，其余10株为禾谷镰刀菌，占83.33%。说明在小麦茎基腐病重病田块，能够从发病的小麦穗部分离到假禾谷镰刀菌，但假禾谷镰刀菌的占比较低。

A：小麦赤霉病分离菌株在PDA培养基中的表型，H01～H12对应的菌株见表3；B：禾谷镰刀菌特异性引物(左)和假禾谷镰刀菌特异性引物(右)对分离菌株的PCR检测结果，M代表DL2000，1～12分别代表菌株H01～H12，CK代表阴性对照(H2O)。

3 讨 论

在中国，假禾谷镰刀菌是目前小麦茎基腐病的优势病原菌。据报道，2009-2013年，在江苏、安徽、河南和河北省小麦种植区，小麦茎基腐病的优势病原菌是亚洲镰刀菌(Fusariumasiaticum)，山东省是禾谷镰刀菌[22-23]。2013-2016年，在河南、河北和山西省南部地区，小麦茎基腐病的优势病原菌是假禾谷镰刀菌；在山东和陕西中部地区，禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌所占的比例相当；在江苏北部和安徽北部地区，禾谷镰刀菌是小麦茎基腐病的优势病原菌[24-26]。本课题组在2016-2019年的调查发现，山东省小麦茎基腐病的优势病原菌是假禾谷镰刀菌。这说明引起中国黄淮地区小麦茎基腐病的假禾谷镰刀菌所占的比例在不断升高，已逐渐成为小麦茎基腐病最主要的病原菌。

目前，由假禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病只在河北省报道过[15-16]。本研究在山东省也发现了由假禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病，推测假禾谷镰刀菌可能正在从侵染小麦茎基部扩展为侵染小麦穗部。假禾谷镰刀菌未能成为小麦赤霉病的优势病原菌，推测可能存在以下几个因素：第一，子囊孢子是小麦赤霉病的主要初侵染源，禾谷镰刀菌是同宗配合子囊菌，而假禾谷镰刀菌是异宗配合子囊菌，在田间两个交配型的菌株数量可能差别较大，难以配对形成子囊壳；第二，假禾谷镰刀菌子囊壳在田间的成熟时间与小麦扬花期错开，只有少数子囊壳在小麦扬花期成熟并喷发；第三，田间环境条件(温度、湿度、光照等)不利于假禾谷镰刀菌形成大量子囊壳。由于黄淮地区小麦茎基腐病不断加重，其优势病原菌假禾谷镰刀菌在土壤中的含量逐渐积累，一旦遇到田间环境条件的改变以及假禾谷镰刀菌两个交配型菌株的均匀分布，形成利于假禾谷镰刀菌侵染小麦穗部的条件，在小麦茎基腐病严重的地区可能会发生由假禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病，需要注意检测。

研究发现，小麦茎基腐病的发生不会在小麦穗部积累过多的毒素，但小麦植株中积累的毒素会对人类及以小麦秸秆为食的动物造成威胁[27]；同时，携带病原菌的小麦秸秆还田能够增加土壤中病原菌的含量。目前尚未见到假禾谷镰刀菌能够侵染玉米的报道，但本研究发现在玉米秸秆上存在禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌的子囊壳，并从中分离出假禾谷镰刀菌，推测可能是玉米收获后在秸秆上腐生的，更多关于假禾谷镰刀菌在玉米上定植的现象需要进一步的田间观察才能确定。秸秆还田耕作制度的推广增加了田间土传病害病原菌的累积，加重了小麦茎基腐病的发生[28]，这可能是小麦茎基腐病近年来突然暴发的重要原因。本研究调查结果进一步证明了假禾谷镰孢菌不仅可以导致小麦茎基腐病，还可以导致小麦赤霉病，从而增加了对小麦生产的威胁。