超高效液相色谱串联质谱法测定龙胆泻肝丸中木通苯乙醇苷B含量*

周云峰，邓杰华，黄招光，吴 喆，黄炳泉，杨建冬

（江西省宜春市检验检测中心，江西 宜春 336000）

龙胆泻肝丸（水丸）的现行质量标准为2020年版《中国药典（一部）》［1］，其对方中龙胆、泽泻、甘草、栀子、黄芩、柴胡、车前子、地黄8种药味进行了定性鉴别或含量测定［2-3］，但对方中木通未进行质量控制，现有报道亦鲜见。木通为木通科木通Akebia quinata（Thunb.）Decne.、三叶木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.或白木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.var.Australis（Diels）Rehd.的干燥藤茎，品种繁杂。与木通名称相近的有川木通［4-5］、关木通［6-7］和甘木通［8］，三者均不属于木通科，与木通的基源差别较大，而在我国中药使用史上木通品种常有混用现象［9-11］。为此，本研究中以木通苯乙醇苷B为定量指标，采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）法考查制剂中木通的质量水平，为提升该制剂的质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：H-class型超高效液相色谱-xevo TQD型三重四极杆质谱仪（美国Waters公司）；MS205DU型十万分之一电子天平、TLE 204E型万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；PL-S60型超声波清洗仪（东莞康士洁超声波科技有限公司）。

试药：龙胆泻肝丸［江西省各地级市17家企业（记为N1-N17），共36批（样品信息见表1），规格包括每100粒6 g，每瓶60 g，每袋3 g或6 g］；木通苯乙醇苷B对照品（批号为111910-201604，含量98.2%）、甘木通对照药材（批号为121443-201102）、川木通对照药材（批号为121409-202003），均购自中国食品药品检定研究院；木通对照药材（湖南省松龄堂中药饮片有限公司，批号为201101）、关木通对照药材（成都德思特生物技术有限公司，批号为DST201219-072），均由江西省宜春市食品药品检验所杨建冬主任中药师鉴定为正品；甲酸、乙腈、甲醇均为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为纯化水。

表1 样品信息及含量测定结果（μg/g，n=3）Tab.1 Information of samples and results of content determination of calceorioside B in samples（μg/g，n=3）

2 方法与结果

2.1 试验条件

色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC®BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～13 min时90%B→25%B，13～17 min时25%B，17～17.01 min时25%B→90%B，17.01～20 min时90%B）；流速为1.0 mL/min；柱温为30℃；进样量为10 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI-），多反应监测模式（MRM）；毛细管电压0.5 kV；锥孔电压-55 V，锥孔气流量50 L/h；脱溶剂气流量900 L/h，脱溶剂气温度550℃；木通苯乙醇苷B检测离子对m/z477→161（定量）、m/z477→133和m/z477→315。

2.2 溶液制备

取木通苯乙醇苷B对照品适量，精密称定，加70%甲醇溶解制成质量浓度为5.170 μg/mL的对照品溶液。取样品细粉0.5 g，精密称定，置100 mL容量瓶中，加入70%甲醇80 mL，超声（功率250 W，频率50 kHz，下同）处理60 min，放冷至室温，加70%甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取木通对照药材0.05 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液，同法制备川木通、关木通、甘木通对照药材溶液，即伪品对照药材溶液。按龙胆泻肝丸处方和工艺制备缺木通的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取上述供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液、伪品对照药材溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1项下试验条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液图谱中，出现与木通对照药材溶液、对照品溶液保留时间一致的色谱峰，质谱响应强度较高。阴性对照品溶液的图谱中虽含有1个与对照品溶液保留时间相似的色谱峰，但质谱响应很弱。提取阴性对照品溶液的相应离子对发现，定量离子对m/z477→161的峰面积可忽略不计，定性离子对m/z477→315无与木通苯乙醇苷B保留时间一致的色谱峰，且通过子离子扫描发现阴性对照品溶液与对照品溶液图谱的一、二级质谱不一致，表明阴性对照品溶液对测定无干扰，专属性良好。另外对川木通、关木通、甘木通对照药材溶液进行分析，其色谱图中均未出现与对照品溶液图谱保留时间一致的色谱峰［12-13］。详见图1。

图1 总离子流图1.Calccorioside BA.Reference solution B.Akebiae Caulis reference solution C.Test solution D.Negative reference solution E.Aristolochiae Caulis medicinal solutionF.Clematidis Armandii Caulis medicinal solution G.Clematidis Filamentosae Folium medicinal solutionFig.1 Total ion chromatograms

线性关系考察：分别精密量取2.2项下对照品溶液0.4，1.0，2.0，4.0，10.0 mL，置10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，制成系列对照品溶液。精密量取10 μL，按2.1项下试验条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=29 941X-227.86（r=0.999 9）。结果表明，木通苯乙醇苷B质量浓度在0.103 4～5.170 0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2项下对照品溶液适量，按2.1项下试验条件连续进样测定6次，记录离子丰度。结果木通苯乙醇苷B峰面积的RSD为2.58%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，6，8，24 h时按2.1项下试验条件进样测定，记录离子丰度。结果，木通苯乙醇苷B峰面积的RSD为3.56%（n=6），表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：精密称取样品（批号13200607）适量，共6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下试验条件进样测定，记录离子丰度并计算含量。结果木通苯乙醇苷B含量平均值的RSD为3.89%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品（批号13200607）适量，共6份，分别加入一定质量浓度的木通苯乙醇苷B对照品溶液适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下试验条件进样测定，记录离子丰度并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 样品含量测定

取36批样品各适量，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下试验条件进样测定，平行测定3次，记录离子丰度并计算样品含量，结果见表1。36批样品均含有木通苯乙醇苷B，含量为14.42～255.02 μg/g。为了解企业间样品中木通苯乙醇苷B含量的差异情况，对同一企业的不同批次样品的含量取平均值，结果见图2。可见，不同企业的样品含量差异显著，推测各企业所采购的样品中木通原料质量差异较大。

图2 各企业样品中木通苯乙醇苷B平均含量分布图Fig.2 Distribution of average content of calceorioside B in samples from different enterprises

3 讨论

预试验中流动相考察了甲醇-0.02%氨溶液、乙腈-0.02%氨溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液4个系统，通过比较离子丰度、目标化合物色谱峰形和仪器耐用性等因素，选择了乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脱）作为流动相；质谱参数方面选择了较稳定的MRM模式进行定量分析，且在负离子模式下，木通苯乙醇苷B的离子丰度较高且稳定。

木通苯乙醇苷B易溶于70%甲醇［14］，故以70%甲醇为提取溶剂，采用超声提取，比较超声30，40，50，60，70 min结果，发现超声50 min后，木通苯乙醇苷B成分即提取完全，考虑方法的可靠性，最终选择加入70%甲醇超声60 min作为提取方法。为排除假阳性成分对含量测定的干扰，对所有市售样品和木通对照药材溶液进行了子离子扫描，其主要子离子均为477，315，179，161，135，101，89，与木通苯乙醇苷B对照品的碎片离子基本一致，且通过计算MRM模式下的离子丰度可知，其结果均在对照品的离子丰度误差范围内，而在阴性对照品和伪品对照药材中均未检出，说明该含量测定方法可行。

本研究中采用UPLC-MS/MS法建立了水丸中木通的质量控制方法，通过对木通苯乙醇苷B的含量分析可知，各企业样品含量差异显著，表明木通原料质量稳定性较低，有必要对龙胆泻肝丸中木通苯乙醇苷B含量拟定限度值，此项工作有待进一步研究。

考虑到有些不法商家可能会利用现行标准不完善的监管漏洞，在生产过程中以假乱真、以次充好、不投料［15-16］，故进一步补充完善龙胆泻肝丸的质量标准、建立制剂中木通含量测定方法对于保障该制剂的安全性、有效性具有重要意义。