EB病毒及EB病毒感染相关淋巴瘤发病机制的研究进展

周小楠 综述 师永红 审校

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV），又称人类疱疹病毒4型，属γ疱疹病毒科。1964年Epstein与Barr首次在Burkitt淋巴瘤（Burkitt’s Lymphoma，BL）中发现该病毒，并命名为EBV。全世界约有95%以上的人口曾感染EBV，绝大多是隐性感染，部分形成传染性单核细胞增多症、咽炎等急性感染[1-3]。此外，因在NK/T细胞淋巴瘤、BL、霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma，HL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）等肿瘤及移植后淋巴组织增殖性疾病（post-transplant lymphoproliferative disorders，PTLD）患者的组织中检测出大量EBV，从而认为EBV与这些类型的淋巴瘤的发生、发展紧密相关，其可能通过抑制免疫系统或诱导不受控制的增殖导致肿瘤的发生。

1 EBV的分子生物学特性及其感染模式

EBV是线性双链DNA病毒，呈球形，基因组长172 kb，主要编码产物包括EBV增殖感染相关抗原：衣壳抗原（viral capsid antigen，VCA）、早期抗原（early antigen，EA）、膜抗原（membrance antigen，MA），以及EBV潜伏感染时表达的抗原[潜伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP），包括LMP1，LMP2A和LMP-2B。EBV核抗原（Epstein-Barr virus antibody，EBNA），包括EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA-3C和LP]。EBV还表达两种小核酸RNA（EBV encoded RNAs，EBER），包括EBER1和EBER2，以及微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）。

EBV的生命周期分为裂解和潜伏两个阶段[2]。其在上皮细胞中进行裂解复制，并在循环记忆B淋巴细胞中建立终生潜伏期，从潜伏期开始周期性地重新激活。依据EBV表达潜伏基因种类的不同，可以将其潜伏感染模式分为0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型4种类型。0型潜伏感染即被EBV感染，处于休眠期的记忆B细胞，仅表达EBV编码潜伏的RNA即EBERs；Ⅰ型潜伏感染，EBV除表达EBERs外，还表达EBV核抗原EBNA1和BamHIA右侧片段（BamHI-A rightward transcripts，BARTs），如BL；Ⅱ型潜伏感染，EBV表达产物包括EBNA1、LMP1、LMP2、EBERs和Bam-HIA片段的转录产物等，鼻咽癌、DLBCL、NK/T细胞淋巴瘤和HL等属于Ⅱ型感染；Ⅲ型潜伏感染，多发生在急性EBV感染或严重免疫缺陷个体中，如艾滋病相关非霍奇金淋巴瘤、传染性单核细胞增多症、器官移植、使用免疫抑制剂等，涉及6种EBNA、3种LMP和2种EBER[1，4]。

2 EBV相关淋巴瘤

2.1 BL

BL是一种高度恶性的B细胞肿瘤。几乎全部地方性BL均为EBV阳性。转录因子MYC调节细胞周期、DNA损伤修复、蛋白质合成等相关基因的表达，并且促进细胞的增殖[5]。BL的一个重要特征是MYC的移位和激活：MYC和免疫球蛋白基因位点之间的易位导致MYC的过度表达，促进细胞恶变，最后导致BL的发生[6]。p53是重要的肿瘤抑制基因，参与细胞生长调控，促进细胞凋亡。研究认为MYC不仅促进细胞增殖，也参与细胞凋亡的调控，如通过多种途径包括生长素响应因子（auxin response factor，ARF）/E3泛素连接酶（E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2，MDM2）/p53途径、核糖体蛋白（ribosomal protein，RP）/MDM2/p53途径和DNA损伤应答途径等激活p53，引起细胞凋亡[5]。抑制p53依赖的长非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）浆细胞瘤多样异位基因1（plasmacytoma variant translocation 1，Pvt1）亚型Pvt1b，可增加MYC水平和转录活性，促进细胞增殖。p53激活Pvt1b来抑制MYC，进而抑制肿瘤发生[7]。EBV编码的LMP1也通过刺激促进细胞增殖、调节炎性反应的锌指蛋白（zinc finger protein A20，A20）基因的表达来阻断p53介导的细胞凋亡[8]。有研究表明，核转录因子TCF3的激活和EBV编码的LMP2A，激活B细胞受体（B cell receptor，BCR）调节肿瘤细胞的增殖和活化，导致细胞恶性转化，进一步与失控的MYC协同，促进细胞存活和BL的发生[9]。此外，EBNA1、EBNA3在BL肿瘤的形成过程中也是不可缺少的。EBV在增殖的宿主细胞中以染色体外遗传物质附加体的形式存在，EBNA1在DNA复制过程中使单链DNA发生交联，在宿主细胞的分裂过程中介导了附加体的复制和分配，并促进细胞迁移和可能的转移扩散[10-11]。由此可见，EBNA1对病毒DNA在感染细胞中的持续存在至关重要[11]。研究表明，EBNA1还可以发挥抗凋亡作用，增强肿瘤的致瘤性[6]。证明EBNA1与影响B细胞生长和功能的基因及细胞增强因子、白介素6受体、早期B细胞因子1等相结合，提高EBV潜伏感染细胞的存活率[12]。EBNA3A和EBNA3C介导各种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的抑制，同时还通过抑制病毒感染和转化的凋亡反应，如抑制促凋亡的B淋巴细胞瘤-2基因（BCL-2）家族成员BIM基因，加强EBV介导的B细胞转化和随后的病毒持久性，进一步促进病毒诱导的增殖和肿瘤发生。而肿瘤抑制因子EBNA3B与EBNA3A和EBNA3C作用相反，其失活则促进免疫逃逸和EBV驱动的淋巴瘤发生[13-14]。有研究表明，缺失EBNA2的基因组可表达细胞BCL-2的病毒类似物BHRF1，赋予BL细胞抗凋亡活性和促生长优势，EBNA2缺失的EBV基因组可以在人源化小鼠中引起类似人类BL淋巴瘤的发生[15]。

2.2 HL

HL的特征是存在霍奇金-李-斯（Hodgkin-Reed-Steinberg，HRS）细胞。利用EBV特异性原位杂交技术检测到EBER在HRS细胞中的表达，证实了EBV与HL的直接联系[6]。HL中的EBV基因组也表达LMP1、LMP2A和EBNA1。端粒重复序列结合因子2（telomeric repeat binding factor，TRF2）可通过结合染色体末端并确保基因组完整性来介导端粒保护。研究表明，LMP1可以下调TRF2，导致端粒功能障碍、复杂染色体重排和多核性，从而诱导RS细胞的形成[16]。LMP1还可模拟活化的肿瘤坏死因子受体超家族成员CD40的受体，募集细胞内重要的接头分子肿瘤坏死因子受体相关因子（TNF receptor-associated factor，TRAF）家族成员TRAF1、TRAF2和TRAF3，激活核因子κB（nuclear factor- kappa B，NF-κB）诱导激酶/抑制剂激活酶，使NF-κB抑制蛋白α磷酸化。进一步激活其下游NF-κB信号通路，通过抑制细胞凋亡来促进细胞存活[1,17]。此外，LMP1还可诱导HRS细胞中异常激活的细胞信号通路，如改变细胞中DNA转录与活性水平的Janus激酶/信号转导与转录激活子（the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）通路、激活多种与肿瘤有关的基因如细胞周期素、胶原酶、溶基质素等表达的激活蛋白-1通路和可诱导强效共刺激分子CD137表达的磷酸肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路[18]，有助于HRS细胞的异常转录。而LMP2A通过激活脾酪氨酸激酶，不仅导致甲基受体蛋白和PI3K激酶等功能都与B细胞受体相似的分子的激活，促进HRS细胞的生存，还增加NF-κB蛋白核易位，从而增加趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-1α的表达，以维持肿瘤微环境，间接促进了HL肿瘤的生存[9,19]。白介素-2受体CD25、趋化因子配体20（CC chemokine ligand 20，CCL20）在调控免疫细胞分化、发育及定向迁移过程中起重要作用，EBNA1已被证明可诱导HL细胞中CD25和CCL20的表达增强，并通过降低Smad2蛋白的半衰期，下调Smad2的表达，抑制转化生长因子-β靶基因肿瘤抑制因子蛋白酪氨酸磷酸酶受体K的转录，从而促进HL的生成[20]。

2.3 DLBCL

DLBCL是最常见的非霍奇金淋巴瘤[4]。研究表明，在EBV阳性DLBCL的绝大多数病例中均检测到克隆性重排和体细胞高度突变[21]。进一步研究显示，EBV阳性DLBCL的形成与NF-κB和JAK/STAT信号通路的激活有关[6,22]。Kato等[23]对EBV感染的DLBCL细胞系进行体外研究和免疫组织化学染色也证实，EBV感染可促进由LMP1C-端胞质结构域触发的NF-κB的激活和信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）3的磷酸化信号，促进细胞转录。聚合酶链式反应检测显示60%EBV阳性DLBCL的病例存在T细胞受体基因重排“受限”或寡克隆[1]，并且在EBV感染下的T细胞衰老、减少或异常也促进淋巴瘤的发生。研究表明，EBV阳性DLBCL的Ⅱ类主要组织相容性复合体蛋白及其转录共激活因子被破坏，BCR信号的完整性及其信号转导受影响，导致EBV阳性DLBCL的抗原捕获和提呈系统受损，同时T细胞过度表达细胞程序性死亡受体-配体1（programmed cell death-ligand 1，PDL1），从而诱导T细胞抑制，导致免疫逃避[24]。此外，EBV还可以诱导DLBCL的肿瘤微环境成分的改变，如LMP1通过诱导STAT1依赖的干扰素-γ分泌，促进B细胞增殖；而LMP2A和EBERs潜伏抗原以及EBV基因组的即刻早期基因（EBV-BZLF1）裂解抗原均促进白介素-10（interleukin-10，IL-10）的产生；由病毒抗原如EBER2和BZLF1触发的白介素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-13（interleukin-13，IL-13）的上调也可能诱导利于EBV感染的肿瘤细胞生长和存活环境的形成[4]。此外，EBV转化的B细胞下调主要组织相容性复合体Ⅰ类分子的表达、EBNA3B中免疫优势T细胞表位发生突变，有助于肿瘤细胞逃避宿主细胞毒性T淋巴细胞的杀伤，逃脱宿主的免疫监视[22]。

2.4 PTLD

PTLD主要来源于移植患者的B细胞，通常与EBV感染有关。有文献报道[25]，约80%的移植后淋巴组织增生性疾病显示EBV阳性。EBV感染不仅使PTLD表达所有潜伏抗原，也改变了miRNA的表达。Felal等[25]研究表明，miRNA-194过表达可增加EBV阳性B细胞淋巴瘤细胞株的凋亡，并抑制IL-10的产生，PTLD患者的基因阵列显示miRNA-194表达被抑制。EBV通过抑制miRNA-194来增加IL-10的表达，IL-10过表达会引起免疫抑制，促进PTLD的生成。PTLD的发病机制不仅涉及病毒的感染的作用，还有一些细胞基因的遗传或表观遗传改变。部分PTLD病例的特征是DNA错配修复机制缺陷导致的微卫星不稳定。此外，PTLD中细胞基因改变还包括细胞凋亡相关的基因如MYC、B淋巴细胞瘤-6基因（BCL-6）、p53的改变、DNA的高甲基化和原癌基因异常体细胞高突变。此外，免疫抑制药物的使用也促进PTLD的发生。器官移植后免疫抑制药物的使用虽然提高了移植的成功率，但会导致EBV特异性T细胞耗尽，降低T细胞的数量和功能，破坏免疫系统和潜伏病毒之间的平衡，从而使EBV从潜伏期重新被激活[26]。除此之外，EBV特异性T细胞介导的免疫监视功能受损导致淋巴母细胞增殖失控，最终导致移植受者出现PTLD[27]。

2.5 NK/T细胞淋巴瘤

虽然EBV感染B细胞更常见，但也可感染上皮细胞以及T淋巴细胞或自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）[2]。EBV感染NK和T细胞，可导致结外NK/T细胞淋巴瘤（extranodal NK/T-cell lymphoma，nasal type，ENKTL）。ENKTL是一种以结外优先受累、EBV相关性和发病地域多样性为特征的淋巴瘤[28]。EBV在ENKTL发生中的重要性于1990年首次被认识[28]。尽管NK细胞不表达EBV的主要受体蛋白CD21，但由EBV感染的B细胞通过突触转移激活的NK细胞，使其获得CD21分子，这些异位受体允许EBV与NK细胞结合，从而引发病毒感染[29]；Smith等[30]通过中和抗体试验，也证明EBV利用病毒糖蛋白gp350和CD21进入成熟的外周T细胞。ENKTL细胞属于Ⅱ型潜伏感染，表达EBV基因EBNA1、LMP1和LMP2[1]。上述基因的表达已经被证明能够结构性地激活JAK/STAT、NF-κB等信号通路，从而促进细胞的生长和存活。有研究认为，LMP1在ENKTL中的表达可通过NF-κB途径上调肿瘤细胞PDL1，来促进肿瘤免疫逃逸[31]；此外，LMP1还通过诱导细胞表面黏附分子CD23、CD40、细胞间黏附分子-1和淋巴细胞功能相关抗原-3的表达，上调抗凋亡蛋白如BCL-2、髓样细胞白血病蛋白-1、BCL2A1同源体、A20，来抑制细胞凋亡并促进肿瘤的发生[3]。

虽然EBV感染被认为是ENKTL发病机制中的早期因素，但附加的基因改变对于淋巴瘤的形成也是必不可少的。最近的研究中，利用二代测序技术在ENKTL患者中发现了频繁的JAK3激活突变[32]。ENKTL的基因组分析也显示，最常见的突变 JAK/STAT信号通路家族的成员，主要是STAT3，其次是肿瘤抑制基因BCL-6辅抑制因子、TP53、RNA解旋酶基因等[28，33]。EBV是激活STAT3的外部因素之一：EBV潜伏蛋白LMP1被认为是STAT激活剂、EBNA2是STAT3转录增强子的辅助激活因子以及JAK/STAT级联反应的下游元件PI3K调节亚基在所有ENKTL样本中都表达上调，导致细胞增殖和存活。Li等[34]研究证明，鸟嘌呤核苷酸结合蛋白q多肽（guanine nucleotide binding protein q polypeptide，GNAQ）基因通过抑制AKT和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路，来抑制ENKTL的生长，体细胞GNAQ T96S突变促进了ENKTL的发病。还有研究认为，ENKTL存在染色体异常，如6q21的缺失，导致许多抑癌基因如自噬相关蛋白5、正性调节区锌指蛋白1、叉头转录因子O3、黑素瘤缺乏因子1和E3泛素蛋白连接酶的表达缺失，抑制肿瘤坏死因子驱动的NF-κB激活而导致凋亡抵抗，促进ENKTL的发生[28，32]。

进一步表观遗传学的研究发现，ENKTL存在细胞周期蛋白的甲基化、组蛋白修饰以及去调控的miRNAs。启动子甲基化异常是ENKTL常见的致癌机制，可导致BIM、凋亡相关蛋白激酶1、蛋白酪氨酸磷酸酶6、甲基胞嘧啶双加氧酶2、细胞因子信号转导抑制剂6和天冬酰胺合成酶等多种抑癌基因的沉默，以及多重肿瘤抑制基因如细胞周期素依赖性激酶抑制剂2A、2B和1A等细胞周期调控基因的沉默，导致细胞正负调节信号不稳定，引起细胞恶性转化，发生肿瘤[28]。通过负性MYC调控Zeste基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）miRNA介导EZH2的上调，使其在ENKTL中发挥致癌特性，促进细胞周期蛋白D1的转录，并通过NF-κB信号通路促进肿瘤的浸润性生长和不良预后[29，32]。表观遗传的另一类调节因子是EBV miRNAs，作为癌基因或肿瘤抑制基因发挥作用，诱导转录后的基因调控。有研究发现ENKTL存在大量对肿瘤生长有抑制作用的miRNAs，包括miR-146a、miR-26a、miR-26b、miR-28-5、miR-101和miR-363的下调[28]，进而抑制细胞NF-κB通路，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，其下调则促进肿瘤的发生[32]。

EBV诱导ENKTL细胞分泌IL-9[29]，进而刺激肿瘤细胞的增殖和侵袭。ENKTL还可分泌IL-2，通过诱导IL-10和干扰素-γ的产生，活化T细胞，促进细胞因子产生，刺激NK细胞增殖，并通过JAK/STAT通路间接上调LMP1的表达，促进ENKTL细胞生长。肿瘤坏死因子CD70与其受体CD27的连接（CD70/CD27）通路，导致T细胞的活化和增殖。EBV阳性的ENKTL细胞株特异性表达可以调控T细胞活化、增殖的CD70，其可通过与可溶性CD27结合，以剂量依赖的方式在淋巴瘤增殖中发挥作用。另外，CD27/CD70信号可能被LMP1上调[35]，加速ENKTL的进展。

3 结语与展望

EBV广泛存在于世界各地的人群中[1]。尽管EBV与多种恶性肿瘤的发病机制有关，但其发病机制尚未阐明；虽然EBV体外感染模型已建立多年，但相关潜伏感染和裂解感染的EBV感染的具体策略，尚未明确。未来的研究应集中在复杂的调控网络与众多转录因子、病毒裂解/潜伏抗原及其相关关系方面。随着对EBV与控制细胞生长和存活的关键细胞通路更多且更深的了解，将逐步解决上述问题，并探索其与癌症的密切联系。