非小细胞肺癌组织DCLK1和Bmi-1蛋白表达及其与三维适形放疗效果的相关性研究

杨开华，周乐源（江南大学附属医院放疗科，江苏无锡 214000）

非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）是常见的呼吸系统恶性肿瘤，约占肺癌的80%，其早期症状不明显，多数患者确诊已进入中晚期，患者的五年生存率较低[1]。中晚期NSCLC患者常采用三维适形放疗以控制肿瘤进展，延长生存期，其放疗效果与患者生存及预后密切相关[2]。双肾上腺素样激酶1（dou-blecortin-like kinase 1，DCLK1）是一种发现在神经元有丝分裂时的微管相关激酶，可为癌细胞生长提供原始能量[3]。B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点一（B cell specific moloney leukemia virus insert site-1，Bmi-1）基因是多梳家族抑制复合体的一员，可调节抑癌基因的表达导致正常细胞发生癌变[4]。既往研究提示[5-6]，NSCLC患者癌组织DCLK1和Bmi-1蛋白存在异常表达，与NSCLC的发生发展有一定关系，但NSCLC组织DCLK1和Bmi-1蛋白表达与三维适形放疗效果的关系尚不明确。鉴于此，本研究检测NSCLC患者癌组织DCLK1和Bmi-1蛋白表达，并探讨其与三维适形放疗效果的关系，以期为临床治疗NSCLC，提高三维适形放疗效果，改善预后提供参考，具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年6月～2021年1月江南大学附属医院收治的102例拟行三维适形放疗的NSCLC患者和40例肺良性肿瘤患者，分别记为恶性组和良性组。恶性组男性75例，女性27例；年龄32～78（58.98±8.28）岁；腺癌54例，鳞癌38例，鳞腺癌6例，大细胞癌4例；高分化21例，中分化36例，低分化43例，未分化2例；Ⅰ期9例，Ⅱ期22例，Ⅲ期47例，Ⅳ期24例；淋巴结转移63例。良性组男性27例，女性13例；年龄32～80（59.97±8.34）岁。二组临床资料对比差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究已经过医院伦理委员会批准。纳入标准：①恶性组均符合NSCLC诊断标准[7]，并经活检病理学确诊为初诊患者；②恶性组均符合三维适形放疗适应症[8]；③良性组均符合肺错构瘤诊断标准[7]，并经病理学检查证实；④均对本研究知情并签署同意书。排除标准：①并发其他原发性恶性肿瘤者；②并发心、肺、肝、肾等器官严重功能不全者；③并发凝血功能障碍、感染、免疫系统疾病者；④精神疾病者；⑤妊娠期、哺乳期妇女。

1.2 仪器与试剂 光学显微镜（日本奥林巴斯，CX43）；直线加速器（德国西门子，6MV-X）；治疗计划系统（德国西门子，Eclipse11.0）；内源性过氧化酶（武汉博士德生物工程有限公司）；磷酸盐缓冲液、二氨基联苯胺显色液（大连宝生物科技有限公司）；苏木素染液（深圳晶美生物科技有限公司）；鼠抗人DCLK1，Bmi-1单克隆抗体（一抗）和兔抗鼠DCLK1，Bmi-1多克隆抗体（二抗）（Abcam中国公司）。

1.3 方法 检测标本采集：收集恶性组活检穿刺的NSCLC组织及良性组手术切除的肿瘤组织，并采用甲醛固定做成石蜡标本。DCLK1和Bmi-1蛋白表达检测：将石蜡标本制成切片，采用二甲苯脱蜡并在不同浓度酒精中依次脱水，每隔3min用蒸馏水浸洗1次，共三次。再滴加内源性过氧化酶10min后，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗后滴加一抗DCLK1或者Bmi-1置于-4℃冰箱过夜，PBS冲洗后加二抗在37℃放置30min，再滴加二氨基联苯胺显色液进行显色反应，蒸馏水冲洗后用苏木素复染2min，用中性树脂封片，置于显微镜下观察。检测结果判断：在显微镜下阅片，细胞核或细胞浆有棕黄色或棕褐色的颗粒为阳性细胞。每个切片观察5个高倍镜下不同视野，将细胞染色阳性率≤25%，25%～50%，50%～75%，75%～100%分别记为1，2，3，4分。染色强度无色、淡黄色、棕黄色和棕褐色记为0，1，2，3分。二项评分乘积：＞4分为表达阳性，≤4分为表达阴性。NSCLC患者采用西门子直线加速器6MV-X进行三维适形放疗，每周5次，放疗6周，总治疗剂量60～70Gy。三维适形放疗效果参照实体瘤治疗疗效评价标准（RECIST1.1）[9]于三维适形放疗后进行评价，分为完全缓解：目标病灶（包括原发病灶和转移淋巴结）完全消失，维持4周；部分缓解：目标病灶（包括原发病灶和转移淋巴结）最长径总和缩小＞30%，维持4周；疾病稳定：目标病灶（包括原发病灶和转移淋巴结）缩小但未达到部分缓解，或增加未达到疾病进展；疾病进展：目标病灶（包括原发病灶和转移淋巴结）最长径总和增加≥20%或出现新病灶。将完全缓解和部分缓解归为有效，疾病稳定和疾病进展归为无效。

1.4 统计学分析 采用SPSS25.0软件作为统计学工具，计量资料均数±标准差（±s）比较采用t检验；计数资料（%）比较采用χ2检验；并采用Logistic回归分析探讨NSCLC患者影响三维适形放疗效果的因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 恶性组和良性组病灶组织DCLK1，Bmi-1蛋白阳性表达率比较 见图1。恶性组病灶组织DCLK1，Bmi-1蛋白阳性表达率分别为60.78%（62/102）和70.59%（72/102），良性组病灶组织DCLK1，Bmi-1蛋白阳性表达率分别为32.50%（13/40）和35.00%（14/40），且恶性组病灶组织DCLK1和Bmi-1蛋白阳性表达率均高于良性组，差异有统计学意义（χ2=9.224，15.241，均P＜0.001）。

图1 病灶组织DCLK1，Bmi-1蛋白表达（免疫组织化学法；×400；刻度尺：50μm）

2.2 恶性组中不同临床病理特征患者癌组织DCLK1，Bmi-1蛋白阳性表达率比较 见表1。临床Ⅲ～Ⅳ期、未/低分化、淋巴结转移患者的DCLK1，Bmi-1蛋白阳性表达率均分别高于临床Ⅰ～Ⅱ期、高/中分化、无淋巴结转移患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 不同临床病理特征NSCLC患者癌组织DCLK1，Bmi-1蛋白阳性表达率比较[n（%）]

2.3 观察三维适形放疗效果 恶性组三维适形放疗后效果完全缓解14例，部分缓解55例，疾病稳定26例，疾病进展7例，有效率为67.65%（69/102），无效率为32.35%（33/102）。

2.4 分析NSCLC患者三维适形放疗无效的影响因素 见表2，3。恶性组三维适形放疗无效患者临床分期Ⅲ～Ⅳ期、未/低分化、淋巴结转移、癌组织的DCLK1，Bmi-1蛋白阳性表达占比均明显高于放疗有效患者，差异有统计学意义（均P＜0.05）；经多因素分析显示临床分期Ⅲ-Ⅳ期、未/低分化、淋巴结转移、癌组织DCLK1和Bmi-1蛋白阳性表达均是恶性组三维适形放疗无效的危险因素（P＜0.05）。

表2 可能影响NSCLC患者三维适形放疗效果的因素比较 [n（%）]

表3 NSCLC患者三维适形放疗无效的多因素分析

3 讨论

非小细胞肺癌（NSCLC）的发生多与吸烟、遗传、环境等因素相关，其癌细胞抑制性强、增殖快、造成恶性程度较高。NSCLC早期症状不明显导致被发现时已进入晚期，晚期患者由于身体无法耐受常采用三维适形放疗[10]。三维适形放疗可降低对病灶组织周围器官的伤害并对病灶靶区进行适当剂量放疗，通过局部控制剂量杀灭肿瘤细胞，进而提高患者的生存时间[11]。本研究中NSCLC患者三维适形放疗无效率为32.35%，稍高于王峥等[12]研究中的30.00%，低于孙祝等[13]研究中的43.59%，可能与患者选取数量、病情进展、治疗依从性等差异有关。放疗无效严重影响患者的身心健康，因此亟需探寻影响三维适形放疗的因素以期为提高NSCLC的三维适形放疗效果提供参考。

本研究中NSCLC组织DCLK1和Bmi-1蛋白阳性表达率均高于肺良性肿瘤组织。DCLK1是蛋白激酶超家族的一员，其编码基因位于人类染色体13g13，该蛋白为DCX家族和蛋白激酶超家族的成员，可表达于脑组织中，且与神经元细胞的迁移及逆行孕鼠等密切相关，其异常表达可影响大脑功能，包括语言、记忆及认知等。另外，DCLK1蛋白高表达的干细胞具有致癌能力，是癌症发生、发展的决定因素，且阻断其表达可增强抗癌疗效。有研究证实[14]，抑制肿瘤干细胞DCLK1蛋白表达可抑制其增殖，并促进细胞凋亡，并且还可缩小实验动物的肿瘤体积并减少肿瘤数目，这有力地印证了该蛋白参与恶性肿瘤的发生和发展。Bmi-1属于多梳家族抑制复合体的原癌基因，在细胞生长、增殖和干细胞更新的调节中发挥重要作用。Bmi-1不仅能够调节细胞增殖和凋亡，还可影响肿瘤细胞的转化和衰老，在恶性肿瘤形成和进展过程中发挥着至关重要的作用。Bmi-1作为肿瘤干细胞基因，其编码的蛋白质可以促进干细胞的不断自我更新和无限恶性增殖，且在包括NSCLC在内的多种实体瘤中均高表达。Bmi-1主要是通过调控端粒酶逆转录酶等途径影响癌细胞的增殖、侵袭和转移等恶性行为，且可通过多种途径影响肿瘤的恶性潜能，包括端粒酶逆转录酶、同源基因途径等，且与患者的病理特征有相关性。有研究显示[15]，DCLK1可通过调节Bmi-1的表达参与胰腺癌的转移，导致预后不良，可知Bmi-1位于DCLK1的下游且受其调控，推测二者可共同参与恶性肿瘤的发生和疾病进展。研究报道[16-17]，DCLK1和Bmi-1蛋白均在NSCLC组织中表达显著增加，本研究结果与上述研究一致，均证实了DCLK1和Bmi-1蛋白高表达与NSCLC发生密切相关。另外本研究显示，临床Ⅲ～Ⅳ期、未/低分化、淋巴结转移患者的NSCLC组织DCLK1和Bmi-1蛋白阳性表达率均分别高于临床Ⅰ～Ⅱ期、高/中分化、无淋巴结转移者，推测DCLK1和Bmi-1蛋白表达可能与NSCLC临床病理特征有一定的关系。研究报道[18]，DCLK1，Bmi-1蛋白阳性表达与临床分期、分化程度、淋巴结转移等有关，分析原因是DCLK1使抑制肿瘤生长的miRNA降低表达，并诱导上皮间质转化从而加速肿瘤发生转移、侵袭[19]；Bmi-1高表达可作为肿瘤启动因子，诱导正常细胞向肿瘤细胞转化，促进细胞凋亡，并通过多种途径参与肿瘤细胞的侵润及转移[20]；二者均参与肿瘤的发生、发展等过程，可在NSCLC呈不同水平表达，从而影响NSCLC的临床病理特征。因此，DCLK1和Bmi-1蛋白表达与NSCLC临床病理特征相关，在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。

本研究结果显示放疗无效组DCLK1和Bmi-1蛋白阳性表达率均高于放疗有效组，且经Logistic回归分析发现二者均是NSCLC患者三维适形放疗无效的危险因素。DCLK1异常高表达可使肿瘤抑制性因子表达降低，从而促进NSCLC的上皮-间质转化，导致细胞间极性及基底膜消失，造成肿瘤侵袭和转移能力增强[21]；DCLK1高表达还可增强NSCLC患者肿瘤组织的恶性潜能，增加恶性肿瘤组织对放射线的抵抗，从而影响三维适形放疗的效果。Bmi-1异常高表达不仅能够影响肿瘤细胞脱氧核糖核酸末端结构的稳定性，导致肿瘤细胞分化障碍，还可抑制抑癌基因表达进而干扰细胞正常周期，造成细胞癌变，在肿瘤的恶性进展中发挥重要作用[22]。Bmi-1蛋白高表达可通过增强癌细胞的增殖、侵袭、迁移活性，增强其耐药性，降低其对放射线的敏感度为肿瘤的生存和生长提供了有利条件。结合上述报道和分析可知，DCLK1和Bmi-1均可通过多种渠道影响NSCLC患者肿瘤组织对三维适形放疗的敏感度，且二者表达水平越高，患者三维适形放疗的效果越差。另外，肿瘤的侵袭、转移及其恶性进展均会影响放疗的效果和预后，故DCLK1，Bmi-1蛋白均是NSCLC患者三维适形放疗无效的影响因素。

此外，本研究还发现临床分期Ⅲ-Ⅳ期，未/低分化、淋巴结转移均是NSCLC患者三维适形放疗无效的影响因素。NSCLC临床分期越高，肿瘤扩散及转移范围越广，放疗效果较差，造成患者生存率降低；NSCLC分化程度越低，其异型性及恶性程度越高，影响放疗效果；淋巴结转移是影响临床分期及预后效果的重要因素，当发生淋巴结转移则提示病情进展较快，难以控制，且预后效果不佳，导致放疗效果较差[23]。因此，临床需关注NSCLC患者三维适行放疗效果的影响因素，以期为临床改善NSCLC患者的放疗效果提供新思路。

综上所述，NSCLC组织DCLK1和Bmi-1蛋白阳性表达率高于肺良性肿瘤组织，且临床分期、分化程度、淋巴结转移、癌组织DCLK1和Bmi-1蛋白阳性表达均是NSCLC三维适形放疗无效的影响因素。尽管DCLK1和Bmi-1蛋白参与恶性肿瘤发生和进展的相关报道较多，但二者与NSCLC三维适形放疗效果的关系尚未见报道，本研究着重探讨该问题具有创新性，且发现二者可影响患者三维适形放疗效果，为NSCLC靶向治疗和增强三维适形放疗敏感度的方案研究提供了新思路。但本研究仍存在不足：NSCLC组织DCLK1，Bmi-1蛋白阳性表达导致三维适形放疗无效的具体机制尚不清楚，后续仍需要进一步探讨，以期为增强NSCLC患者三维实行放疗效果的研究提供新思路。