基于网络药理学和分子对接研究参松养心胶囊治疗心房颤动的作用机制

王洪伟 王 贺 司春婴 解金红 关怀敏

(1 河南中医药大学，郑州，450000； 2 河南中医药大学第一附属医院心血管内科第三病区，郑州，450000； 3 河南中医药大学第一附属医院心脏中心，郑州，450000)

心房颤动(Atrial Fibrillation，AF)是较为常见的心律失常，其患病率逐年增加，至2016年，全球有4 630万人患有AF或心房扑动，据估计成人AF的患病率为2%～4%[1]。此外，AF患者并发卒中的风险是正常人的5倍，据估计占所有卒中的15%[2]，预计到2050年AF将导致全球范围内100.8亿失能调整生命年(Disability-Adjusted Life Year，DALY)的损失及42.7万人死亡[3]。并且在各种心律失常中，由AF引起的并发症影响巨大而受到世界卫生组织的极大关注[4]。目前，主要采取药物和消融的方式达到治疗AF目的，其中药物治疗以控制心室率、恢复窦性心律、抗凝治疗为主，临床研究发现这些抗心律失常药有较大的致心律失常的风险；而消融术虽能达到治疗AF的目的，但其有价格昂贵和高复发的缺陷[5-6]。随着对中医药的深入研究发现，中医药在AF的治疗方面有着巨大潜力，并且有低成本、低不良反应、高疗效的优势。

中医根据AF的症状将其归属于心悸动、惊悸、怔忡、雀啄等范畴，主要症状为心悸、脉结，常伴头晕、胸闷、气短等[7]。根据临床证候的不同，将AF的证型分为气阴两虚证、气滞血瘀证、心肾不交证、肝肾阴虚证、阳虚湿阻证和络风内动证6种，其中以气阴两虚证在临床上较为常见[8]。参松养心胶囊由赤芍、丹参、甘松、黄连、炒酸枣仁、南五味子、人参、桑寄生、山茱萸、麦门冬等药物组成[9]。有益气养阴，活血通络，清心安神的功效，临床主要用于治疗气阴两虚证[10]。此外，有研究表明参松养心胶囊联合胺碘酮对气阴两虚型AF较单用胺碘酮疗效更佳[11]。但目前参松养心胶囊在AF的治疗中的作用机制尚未清楚，本研究利用网络药理学及分子对接技术，旨在探索分析参松养心胶囊的药物活性成分和治疗AF的潜在作用靶点，从而预测参松养心胶囊在AF治疗中潜在作用机制，为以后相关研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 数据库与软件 中药系统药理数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)；中医药百科全书数据库(Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/)；有机小分子生物活性数据库(PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Swiss Target Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/)；String数据库(https://www.string-db.org/)；UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)；人类基因数据库(Human Gene Database，GeneCards，https://genealacart.genecards.org/)；在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/)；遗传药理学和药物基因组学数据库(PharmGKB，https://www.pharmgkb.org/)；治疗性靶点数据库(Therapeutic Target Database，TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)；综合性药物数据库(DrugBank，https://go.drugbank.com/)；疾病相关基因数据库(DisGeNET，https://www.disgenet.org/)；Draw Venn Diagram在线数据平台(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)；Cytoscape 3.8.0软件；R4.0.5软件；DOSE、clusterProfiler、enrichplot R软件包；String数据库(https://string-db.org)；CytoNCA插件；MCODE插件；PDB蛋白质在线数据库(https://www1.rcsb.org/)；ChemBio 3D 20软件；AutoDock vina软件；PyMOL软件。

1.2 参松养心胶囊活性成分的获取 利用TCMSP、ETCM数据库检索参松养心胶囊中赤芍、丹参、甘松、黄连、南五味子、人参、桑寄生、山茱萸、炒酸枣仁、麦门冬等药物化学成分，根据药物动力学特征筛选药物活性成分，设置口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18[12]，ETCM保留可靠性分值大于0.8的活性成分。对于TCMSP数据库中查询不到的作用靶点，通过Pubchem数据库找到药物活性成分的2D结构，下载SDF文件格式上传Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测，将上述二部分数据进行整合，利用String数据库进行标准化处理获得靶点相应基因名，运用UniProt数据库对String数据未能获得的靶基因进行补充。

1.3 AF疾病相关靶点获取 以“Atrial Fibrillation”为关键检索词，以“Homo Sapiens”为目标物种，通过检索GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD、DrugBank、DISGeNET等数据库，获取与AF相关的疾病靶点。

1.4 参松养心胶囊治疗AF的潜在疾病靶点的获取 使用Draw Venn Diagram在线数据平台对1.2及1.3中所获得的药物活性成分靶点及AF疾病靶点绘制韦恩图，二者的交集即为参松养心胶囊治疗AF的潜在治疗靶点。

1.5 药物活性成分与AF潜在靶点网络的构建 整理1.4获得的潜在作用靶点，为了找出作用于AF疾病靶点的单味药及药物活性成分，建立以节点表示单味药、药物活性成分、成分或疾病的靶点，而边则表示节点与节点之间的相互关系，以此构建药物-药物活性成分-AF潜在治疗靶点的相互作用的网络关系表；将其导入Cytoscape软件中绘制药物-药物活性成分-AF潜在治疗靶点网络图，同时计算每个节点相对应的度值，并以每个节点度值的大小调节节点的大小。

1.6 基因本体功能分析和KEGG通路富集分析 利用R软件借助脚本，将1.4获得的“药物成分-AF”共同靶点的基因名转换为Entrez ID，并将DOSE、clusterProfiler、enrichplot软件包载入R软件中，通过运行ClusterProfiler功能包进行基因本体(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，其中“P<0.05”，并以P值大小从小到大排列，GO功能分析结果取前10位和KEGG通路富集分析结果取前20位，将结果可视化分析并绘制气泡图、条形图。

1.7 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建及AF潜在治疗靶点的筛选 将1.4中获得的药物成分与疾病公共靶点导入String数据库，物种选择“Homo Sapiens”，最低互作分数设置为“Highest Confidence(0.9)”获得蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)关系，将分析结果导出并运用Cytoscape软件绘制潜在作用靶点的PPI网络；使用CytoNCA插件对初始网络节点的拓扑学属性的中位数作为筛选标准进行了2步筛选简化网络，使用MCODE插件以默认参数应用插件得到不同的靶点团[13]，得分(Score)越高越能说明该靶点是参松养心胶囊治疗AF的核心靶点团。MCODE Score反映每个节点与其他节点的联系紧密度[14]。

1.8 分子对接 利用PDB数据库对1.6获得核心靶点3D结构进行检索并下载其PDB格式，并用PyMOL软件对其去水和去配体；利用AutoDock vina软件对其加氢，并将其设置为受体保存为PDBQT格式；通过反向分子筛选得到参松养心胶囊中相应的药物活性成分，利用PubChem数据中下载其对应的2D结构，将其导入Chem3D软件对其进行能量最小化处理存为MOL2格式，再分别导入AutoDock vina软件，确定可旋转化学键个数，将其设置为配体输出为PDBQT格式；确定分子对接受体的活性口袋，并将设置参数为“exhaustiveness=25、energy_range=5、num_modes=20”，使用AutoDock Vina软件进行分子对接对接。最后，利用PyMOL软件对分子对接结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 活性成分的筛选及作用靶点预测 通过多数据库联合文献检索分析，经类药性五原则对其进行筛选共检索到参松养心胶囊药物活性成分190个，成分基因818个。见表1。将活性成分对应的蛋白去重后导入String数据库将成分蛋白转换为基因名，使用UniProt数据库对其补充，共获得参松养心胶囊活性成分靶点基因262个。

表1 参松养心胶囊包含活性成分及对应靶点数

2.2 参松养心胶囊药物活性成分-AF潜在靶点网络 共得到AF疾病相关靶点3 577个与2.1筛选得到参松养心胶囊药物活性成分靶点262个，最终获得171个参松养心胶囊治疗AF的潜在靶点。见图1。将这171个潜在靶点连同参松养心胶囊单味药及药物活性成分共同靶点导入Cytoscape软件构建药物-药物活性成分-AF靶点网络图。结果说明参松养心胶囊治疗AF是通过多成分、多靶点发挥作用。见图2。

2.3 AF潜在治疗靶点GO生物功能分析 GO生物功能分析结果显示共得到基因功能相关信息2 837个。其中参松养心胶囊活性成分治疗AF潜在的靶点在生物过程(Biological Processes，BP)中富集了2 545个GO功能，主要富集于对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、对金属离子的反应、对药物的反应、细胞对化学应激的反应、氧化应激反应、细胞对氧化应激的反应、神经元死亡、对活性氧的反应、细胞对生物刺激的反应；在细胞组分(Cell Components，CC)中富集了107个GO功能，主要富集在膜筏、膜微区、膜区、小窝、质膜筏、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、囊腔、蛋白激酶复合物、转录调节复合物、胞质泡腔；在分子功能(Molecular Functions，MF)中富集了185个GO功能，主要和DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、核受体活性、配体激活转录因子活性、泛素样蛋白质连接酶结合、泛素-蛋白质连接酶结合、细胞因子受体结合、儿茶酚胺结合、蛋白酶结合、磷酸酶结合有关。见图3。

2.4 AF潜在治疗靶点KEGG通路富集分析 应用R校对对AF潜在治疗靶点进行KEGG通路富集分析，经过运算得到AF潜在治疗靶点参与信号通路183条，通过q值由小到大排序，取前20位。见表2。其中有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE Signaling Pathway In Diabetic Complications)、IL-17信号通路(IL-17 Signaling Pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF Signaling Pathway)、MAPK信号通路(MAPK Signaling Pathway)、细胞凋亡(Apoptosis)、HIF-1信号通路(HIF-1 Signaling Pathway)6条信号通路与AF的发生维持及治疗密切相关。见图4。KEGG分析结果说明参松养心胶囊治疗AF是通过多条信号通路实现，其中MAPK信号通路可能是参松养心胶囊治疗AF主要涉及的信号通路。见图5。

表2 参松养心胶囊治疗AF潜在靶点的KEGG富集通路

2.5 AF潜在治疗靶点PPI网络分析 PPI网络由152个节点及716条边组成。见图6A。第一次拓扑学分析得到由35个节点与195条边构成简化的PPI网络。见图6B。第二次拓扑学分析最终构成由7个节点与19条边组成的核心靶点团。见图6C。PPI结果显示，参松养心胶囊主要通过作用于MAPK(丝裂原激活蛋白激酶)1、MAPK8、MAPK14、Jun激酶、STAT(信号转导及转录激活因子)3、FOS(Fos原癌基因)、TNF(肿瘤坏死因子)治疗AF。

2.6 参松养心胶囊成分与AF治疗潜在靶点蛋白分子对接分析 将2.5经拓扑学分析最终获得核心靶团MAPK1、MAPK8、MAPK14、JUN、STAT3、FOS、TNF通过反向分子筛选得到参松养心胶囊治疗AF的10个药物活性成分；利用Pubchem在线数据检索得到其相应的2D结构(其中MAPK14尚未找到相对应2D结构)，对上述检索到的9个活性成分运用ChemBio 3D 20软件使其能量最小化；利用PDB蛋白质在线数据库检索下载AF潜在治疗靶基因相对应的蛋白质结构文件MAPK1(PDB ID:2Y9Q)、MAPK8(PDB ID:2XRW)、STAT3(PDB ID：6NJS)、JUN(PDB ID：5FV8)、TNF(PDB ID:7JRA)、FOS(PDB ID:1A02)；采用autoduck vina软件依次与小分子化合物进行虚拟对接，对接结果见表3。分子虚拟对接结合能(affinity)<-7 kcal/mol(1 cal=4.184 J)时则认为配体与受体结合活性较好且结合能越低则说明分子对接结果越好。分子对接结果显示，有39对结合能少于-7 kcal/mol药物成分与靶点蛋白，其中排在前5位的配体与受体以隐丹参酮与MAPK1的结合活性最好(affinity=-10 kcal/mol)，随后依次是隐丹参酮与MAPK8(affinity=-9.9 kcal/mol)、黄芩素与TNF(affinity=-9.3 kcal/mol)、木犀草素与MAPK1(affinity=-9.1 kcal/mol)、山柰酚与MAPK1(affinity=-9.1 kcal/mol)；利用Pymol对分子对接结果进行可视化处理，药物活性成分配体均能与靶蛋白受体的活性口袋结合且二者匹配良好，部分分子对接图。见图7。

表3 核心靶蛋白团与其反向筛选的药物活性成分的分子对接结果(1 cal=4.184 J)

3 讨论

AF的发病机制，涉及心房电结构重构、代谢重构、炎症反应、氧化应激反应、折返环路学说、神经体液学说、分子遗传学说等方面[8]。目前AF治疗主要从恢复窦性心律、控制心室率和抗凝等角度入手。但AF患者恢复窦性心律后有较高的复发率，并且在使用抗心律失常药物的过程中存在较高致心律失常的风险。AF属于中医“心悸”范畴,临床上的AF患者根据证候群分多为气阴两虚证型，参松养心胶囊具有益气养阴、活血通络、清心安神的功效，是治疗气阴两虚证的常用药物[10]。

本研究应用网络药理学方法，研究发现参松养心胶囊中的多种药物活性成分通过多个靶点蛋白发挥治疗AF的作用，这些靶点蛋白经GO富集分析，结果显示参松养心胶囊的药物活性成分主要影响氧化应激反应、金属离子反应、应激反应及活性氧等生物过程；参与蛋白的合成、转运及离子通道复合物合成；调节基因的表达，蛋白的功能及降解等。PPI网络结果显示MAPK1、MAPK8、MAPK14、JUN、STAT3、FOS、TNF是参松养心胶囊治疗AF的潜在作用靶点；分子对接的结果显示参松养心胶囊药物活性成分与AF治疗靶点蛋白对接良好，以隐丹参酮与MAPK1的结合活性最好，随后依次是隐丹参酮与MAPK8、黄芩素与TNF、木犀草素与MAPK1、山柰酚与MAPK1。因此，参松养心胶囊的活性药效成分可以通过作用于潜在靶点MAPK1对AF治疗发挥作用。

KEGG富集分析显示有6条信号通路与AF有着密切相关，MAPK信号通路调控细胞的生长、分化、应激、炎症反应等多种重要的生理病理过程。Gao等[15]发现MAPK信号通路的激活促进心房纤维化的发生。Cheng等[16]实验证明激活的MAPK信号通路可使得L型钙通道和Kv4.3钾通道表达发生改变可能是心房电重构的基础。说明参松养心胶囊可以通过抑制MAPK信号通路抑制心房电结构重构。

糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路通过激活PKC/JNK/NF-κB信号通路，使得白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α在内的多种细胞炎症介质的表达上调。除此之外，它还可激活PCK/PK-1信号通路，使得单核细胞趋化蛋白-1、基质金属蛋白酶-2、细胞间黏附分子-1等蛋白过表达，进而使得血液黏滞度增加，致使AF合并糖尿病患者易形成血栓。Burr等[17]认为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路通过促进心肌细胞中成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，进而促进细胞外基质合成增加。研究者还发现AGE-RAGE信号通路使心肌细胞氧化应激反应增强。因此，参松养心胶囊可能通过抗炎、抗氧化、抑制心房结构重构及降低血液黏滞度抑制血栓形成发挥治疗AF合并糖尿病的药理学作用。

此外，Yue等[18]实验发现白细胞介素-17通过激活下游的核因子кB和MAPK信号通路促进心房电结构重构；He等[19]研究发现肿瘤坏死因子-α通过促进KCa3.1通道蛋白的表达，从而促进心房电重构；Deng等[20]认为细胞凋亡在AF发生和维持的过程中发挥一定的作用。以上证据表明参松养心胶囊可能通过作用于IL-17、TNF、细胞凋亡信号通路发挥治疗AF的作用。

综上所述，本研究基于网络药理学方法及虚拟分子对接技术预测参松养心胶囊治疗AF的药物活性成分、潜在作用靶点及可能的作用机制，并认为参松养心胶囊药物活性成分可能通过作用于潜在靶点MAPK1影响心房电结构重构、调节代谢、抑制炎症反应、调节细胞凋亡相关的多条信号通路达到治疗AF的作用，为临床应用参松养心胶囊治疗AF提供了参考。