碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌耐药机制研究进展

田雨，关晓雯，刘萌，魏莲花

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000)

0 引言

耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌对全球公共卫生构成的威胁呈指数级增长，这些细菌具有多种多样的耐药机制，使得由碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)引起的感染控制和早期检测变得困难。近年来，研究者们迫切需要制定新的治疗指南来治疗 CRKP感染以减缓耐药性的出现。因此本文主要以 CRKP 耐药机制、遗传背景等对当前CRKP 感染的研究进行综述，望为临床有效治疗CRKP 感染提供依据及参考。

1 流行性分析

肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)是一种重要的肠杆菌科细菌，在医院和社区获得性感染中可导致多种感染，如呼吸道感染、尿路感染和血液感染等。随着抗生素的频繁使用，革兰阴性杆菌(MDRGN)多重耐药引起的感染已成为一个日益严重的全球性问题。碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP)可由于CRKP定植、碳青霉烯类暴露、较长的住院时间、重症监护病房 (ICU) 停留时间和手术史而导致血流感染(Bloodstram Infection，BSI)，这些被认为是耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌血流感染(CRKP-BSI)的独立危险因素[1-2]。同时，碳青霉烯类抗生素对产生多药和广谱β-内酰胺酶的菌株有效，但随着碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌分离率的提高，肺炎克雷伯菌的耐药性一直在增加[3]，由碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)引起的感染也越来越受到重视，临床治疗面临新的困境[4-5]。

肠杆菌科细菌对强效抗生素碳青霉烯类抗生素耐药性的对全球公共卫生的威胁日益严重。在我国，对碳青霉烯类抗生素的耐药性监测显示，对碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科(CRE)数量逐年增加，其中CRKP占最重要的比例(64.2%)[6]。统计数据表明，2017年中国和欧洲的抗生素耐药性监测网络均显示对碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌的检出率有所提高：中国从2013年的4.9%增长至2017年的9.0%，而上海的惊人增幅为26.9%；同时欧洲CRKP的比率保持相对不变，从2014年的7.3%到2017年的7.2%，变化最大的是希腊从62.3到64.7%[7-8]。根据CHINET耐药性网络监测显示，2005-2020年这16年肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率从2005年的3.0%和2.9%持续上升至2018年的25.0%和26.3%，对亚胺培南的耐药性从2016年的16.1%迅速上升至2017年的20.9%和2018年的25.0%，从2019年和2020年开始呈下降趋势，但仍在23%以上[9-10]。因此，中国的CRKP耐药性正在以令人震惊的速度上升，这使得人们越来越重视CRKP的耐药机制研究。

2 耐药机制

肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性与不同的机制有关。碳青霉烯的肺炎克雷伯菌(CRKP) 通过两种主要机制使碳青霉烯失活：(1)获得编码能够水解碳青霉烯的酶的碳青霉烯酶基因——三种最重要的碳青霉烯酶类型是A类KPC型酶、B类金属β-内酰胺酶(VIM、IMP、NDM) 和D类 OXA-48 型酶；(2)通过定量和/或定性缺乏孔蛋白表达以及对碳青霉烯类具有弱亲和力的 β-内酰胺酶的过度表达来减少抗生素的堆积[11]。还可质粒型AmpC酶的过度表达和窗孔蛋白的丢失、碳青霉烯类高亲和力位点PBP2的数量下降、亲和力丧失或降低等有关[12,13]。通透性缺陷的同时产生的β-内酰胺酶具有非常弱的碳青霉烯酶活性，可能导致对碳青霉烯类药物，特别是厄他培南的敏感性降低[14]。这些酶可以是Ambler A类超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)或Ambler C类AmpC头孢菌素酶，其中一些酶(即CTX-M-15、CMY-2)在结合通透性缺陷时更有可能降低碳青霉烯类药物的敏感性[15]。

2.1 A类KPC型β-内酰胺酶

肺炎克雷伯氏菌主要产生的是A类KPC型β-内酰胺酶[16]，目前已发现了20多种KPC变体，其中KPC-2和-3仍然是最常见的变体[17]。这些酶对青霉素，碳青霉烯类，头孢菌素，头孢菌素和单巴坦类产生耐药性，并被β-内酰胺酶抑制剂(如克拉维酸(弱)，他唑巴坦(弱)，硼酸和阿维巴坦(avibactam)抑制[18]。目前产生KPC的细菌被认为是世界上某些地区的地方病，例如在美国东北部，波多黎各，哥伦比亚，希腊，意大利，以色列和中国，并且是其中某些地区和国家医院获得性感染的重要原因[19]。在耐药性研究中心最主要的是带有KPC-2和KPC-3的ST258的肺炎克雷伯氏菌，此外，还有研究表明GES-5是另一种A类碳青霉烯酶，是GES-1的点突变衍生物[20]。

2.2 B类β-内酰胺酶

在不同肠道细菌中也发现了肺炎克雷伯氏菌中鉴别出来的还有B类β-内酰胺酶或金属-β-内酰胺酶(MBLs)获得性金属β-内酰胺酶(MBL)是一种碳青霉烯酶，可水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素(单酰胺类除外)[14]。主要有NDM型，VIM型和IMP型酶，其中NDM型是全世界最常见的酶。虽然IMP主要在中国、日本和澳大利亚被鉴定，但产VIM的肺炎克氏菌主要分布在意大利和希腊[14]。NDM-1与其他获得性金属β-内酰胺酶(MBL)几乎没有同一性，最相近的是VIM-1/VIM-2型，有32.4%的氨基酸具有同一性。自发现NDM-1以来，已经描述了该酶的10多种变体，其中大多数起源于亚洲[21]。MBLs的细菌通常对青霉素，碳青霉烯，头孢菌素和头孢菌素产生耐药性，但对单杆菌素仍敏感，其活性受到金属螯合剂(如EDTA和二吡啶甲酸)的抑制。大多数NDM-1产生菌还有多种其他抗药性机制[14]，包括：质粒介导的AmpCβ-内酰胺酶(特别是CMY类型)，ESBLs(特别是CTX-M-15)，不同的碳青霉烯酶(例如OXA-48，VIM和KPC类型)，16S rRNA甲基转移酶，质粒介导的喹诺酮抗性决定簇，大环内酯修饰酯酶和利福平修饰酶等。因此，带有NDM型酶的肠杆菌科仍然对诸如大肠菌素，磷霉素和替加环素等药物最敏感[20]。

2.3 D类 OXA-48 型酶

肺炎克雷伯菌分离株中发现的D类碳青霉烯水解β-内酰胺酶是OXA-48(及其衍生物)，首次发现于法国巴黎的土耳其耐多药肺炎克雷伯菌分离株(MDR肺炎克雷伯菌)中[22]。OXA-48能有效水解窄谱β-内酰胺类药物，如青霉素，弱水解碳青霉烯类药物和广谱头孢菌素[23]。进一步的研究表明，这种产 OXA-48 的肺炎克雷伯菌共表达多种 β-内酰胺酶，包括 A 类超广谱 β-内酰胺酶 (ESBL) SHV-2a 和窄谱 β-内酰胺酶 TEM-1 和 OXA -47，并且在几种外膜蛋白中表现出缺陷，导致其高水平的抗生素抗性模式[24]。它在肠杆菌科的菌中都有发现，主要存在于肺炎克雷伯菌(主要来源于医院)和大肠杆菌(主要来源于社区)的分离物中。产OXA-48的肺炎克雷伯菌在土耳其和某些北非和欧洲国家(如摩洛哥、突尼斯、西班牙、比利时)流行，并表现出广泛的易感性特征[22]。事实上，碳青霉烯类抗生素的MIC在不同的分离物之间可能有很大的差异，这取决于宿主的通透性背景。类似地，对广谱头孢菌素的敏感性也会发生显著变化，这取决于其他β-内酰胺酶(如ESBLs)的共同产生。在肺炎克雷伯菌中也发现了一些OXA-48衍生物，即OXA-181、OXA-204和OXA-232，它们都具有类似的水解特性[25]。这些酶已在北非、澳大利亚和新西兰被发现，印度大陆是OXA-181(第二大最常见的OXA-48衍生物)的主要来源之一。另有研究在阿根廷发现了一种不同的OXA-48同功酶OXA-163，它的不同之处在于一个单一的氨基酸取代和四个氨基酸缺失[26]。这种变体表现出特殊的水解特性，对广谱头孢菌素水解活性强，对碳青霉烯类抗生素的活性较弱。

碳青霉烯酶具有不同的水解活性，MBLs和KPC酶比OXA-48类酶更有效地水解碳青霉烯。然而，在具有碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌分离株中，无论产生哪种碳青霉烯酶，高水平的碳青霉烯耐药性都需要额外的通透性缺陷[20]。相反，已鉴定出肺炎克雷伯菌的分离物，其所有类型的碳青霉烯酶均显示出较低的碳青霉烯MIC。肺炎克雷伯菌与碳青霉烯酶的最初传播可能是由于分离株的碳青霉烯MIC较低，且无通透性改变[27]。

3 遗传背景

近年来，许多国家都报道了CRKP基于多位点序列分型(MLST)的分子流行病学数据显示肺炎克雷伯菌ST型多种多样[3]。各种报道表明ST型与菌株的耐药性有关。例如，肺炎克雷伯菌ST258型是美国和希腊最常见的碳青霉烯类耐药ST型[4,5]，ST340型与产生NDM-1碳青霉烯的肺炎克雷伯菌有关[6]。在全球范围内，最常见的CRKP 菌株是 ST11 和 ST258，碳青霉烯酶基因通过流行的致病菌株进行克隆扩增而在世界范围内传播[28]。大多数国家(包括美国和欧洲国家)产KPC 的肺炎克雷伯菌的传播主要是由单一优势菌株 ST258 的扩增引起的[29]。ST258克隆仍然是产KPC肺炎克雷伯菌主要克隆型，占产KPC的80%[30]。ST258是由ST11和ST442之间的杂交克隆，80% 的基因组来源于 ST11 样菌株，20% 来源于 ST442 样菌株[31]。尚不清楚为什么ST258 谱系是产生 KPC 的克雷伯菌属最普遍的克隆，ST258 克隆对动物模型中对血清杀伤高度敏感，并且缺乏肺炎克雷伯菌毒力因子，如产气杆菌素基因、K1、K2 和 K5 荚膜抗原基因，以及粘液表型基因rmpA的调节因子[32]。

有研究显示，ST258 菌株由两个不同的遗传分支组成(cps-1和cps-2 )，两者间的遗传分化源于约215 kb 的分歧区域，其中包括参与荚膜多糖合成的cps基因，多重 PCR检测了肺炎克雷伯菌ST258菌株中两种荚膜类型，表明cps类型和 KPC 变异之间有显著关联：cps-1分支主要与 KPC-2 相关，而cps-2分支主要与KPC-3有关[33]。由于荚膜多糖可以助肺炎克雷伯菌逃避吞噬作用，该菌株的全球流行可能与荚膜多糖生物合成区域cps-1和cps-2有关。另有研究表明，整合共轭元件 ICEKp258.2 与 ST258 间的关系，ICEKp258.2 包含两个特定的基因簇，一个 Ⅳ型菌毛基因簇(即pilV)，与质粒的摄取和交换及对活体和非活体表面的粘附相关，另一个Ⅲ型限制修饰系统的基因簇，该基因簇确定某些相容质粒或移动元件交换中的宿主特异性[34]。由于这些与质粒和特定移动元件限制相关的基因仅存在于 ST258 和基因相关序列类型中，这种差异可能解释 ST258 主要携带 KPC 和 ST11 的差异，ST11 是另一个缺乏 ICEKp258.2 的高风险克隆，携带广泛的质粒和碳青霉烯酶，包括 KPC、NDM、OXA-48、VIM 和 IMP[11]。尽管 ST258 菌株的 ICEKp258.2 型在全球范围内流行，但 ST258 菌株在产生 KPC 的肺炎克雷伯菌中占优势的确切原因仍未完全了解。ST11、ST14、ST101、ST147 和 ST258 是主要的产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌克隆，ST258 主要在产 KPC 的肺炎克雷伯菌中发现，而其他克隆型则在各种产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌中发现。

4 小结与展望

碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)对所有年龄段的患者构成越来越大的威胁，并且引起的感染也越来越受到重视，临床治疗面临新的困境，而无论碳青霉烯酶是哪种类型，均需要精心设计大型随机对照试验和其他干预评估的流行病学研究和监测，通过分子特征鉴定来及早认识这些肺炎克雷伯菌克隆的传播动态、风险因素和宿主，将对 CRKP 监测、感染预防、制定有效的治疗方案和遏制这些危险序列类型的传播提供必要信息。