21-羟化酶缺乏症的分子诊断及临床意义

吕拥芬，李 嫔

上海市儿童医院，上海交通大学医学院附属儿童医院内分泌科，上海 200062

先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一组常染色体隐性遗传性疾病。其由于类固醇合成酶缺陷，导致肾上腺皮质多种类固醇激素合成不足，促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）升高，肾上腺皮质增生，孕酮等前体物质堆积而导致皮质激素缺乏及继发高雄激素等症候群。21-羟化酶缺乏症（21-hydroxylase deficiency，21-OHD）导致的CAH 占90%～95%［1］。21-OHD 由编码肾上腺类固醇21-羟化酶（P450c21）的CYP21A2基因变异引起。该酶将17-羟孕酮（17-hydroxyprogesterone，17-OHP）转化为11-脱氧皮质醇，将孕酮转化为11-脱氧皮质酮，这些产物是皮质醇和醛固酮的前体。根据临床表现、生化特征等，又可将21-OHD 导致的CAH 分为3 型：失盐型（salt wasting，SW）、单纯男性化型（simple virilizing，SV）和非经典型CAH（nonclassic congenital adrenal hyperplasia，NCCAH）。SW 型和SV 型CAH 因具有显著临床特征以及生化特点，又称为经典型CAH。全球CAH 发病率为1/14 000～1/18 000［2］；美国非洲裔经典型CAH 发病率低得多，在不同的研究中为1/25 000～1/42 000［3］。国内报道的CAH发病率为1/16 466～1/12 200［4］。

目前，对于21-OHD 的诊断主要是通过临床症状和实验室检测。由于该病临床谱带广，实验室检测结果受多种因素影响，易发生误诊或漏诊。以17-OHP为例，其是21-OHD 新生儿筛查的一线指标，检测值受胎龄、出生体质量、标本采集时日龄及测定方法等因素影响，导致筛查结果有一定假阳性和假阴性率。而且，17-OHP 易受多种因素影响而波动，如应激、感染、服药时间等，故不能单纯根据17-OHP 浓度进行疾病分型。2016 年以来，《先天性肾上腺皮质增生症21-羟化酶缺陷诊治共识》《先天性肾上腺皮质增生症新生儿筛查共识》及《新生儿先天性肾上腺皮质增生症筛查与诊断实验室检测技术专家共识》等相继发表。这些共识都提到CAH 诊断的金标准是基因检测，并建议常规开展，尤其对于临床上疑似而实验室诊断困难，或诊断不明已予以糖皮质激素治疗者。当其与其他疾病如21-OHD以外的CAH、先天性遗传性肾上腺发育不良等进行鉴别时，需行基因检测助诊。在先症者及父母基因型明确的基础上，基因检测可为需要再生育的CAH 家庭提供产前诊断［5］。因此，分子检测对于21-OHD 的诊断、鉴别诊断、治疗、携带者检测、遗传咨询等具有重要意义。鉴于以上共识中均未详细提及21-OHD 基因变异的分子基础，本文拟总结该病分子变异的致病形式、基因型与表型相关性、基因分型对治疗及遗传咨询的指导，以期为临床上21-OHD分子诊断提供参考。

1 21-OHD分子变异的致病形式

21-羟化酶由功能基因CYP21A2编码，位于染色体6p21.3，长度3.3 kb，在人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）复合体Ⅲ内；该区域基因结构复杂，在长度和拷贝数上有很大的变异性［6］。在CYP21A2基因约30 kb 处有一个非功能的假基因CYP21A1P。功能基因和假基因均含有10 个外显子，外显子和内含子同源性分别达98%和96%。假基因CYP21A1P因存在小插入、缺失和点突变等多个致病变异而阻止了功能蛋白的合成。在CYP21A2和CYP21A1P基因附近有其他3个基因RP1、C4、TNXB以及2 个截短的假基因RP2和TNXA，共同构成了RCCX 模块（RP-C4-CYP21-TNX），并对应着一个高度可变的约30 kb 的DNA 序列［7］。最常见的结构形式是双模块，即串联形成双拷贝RCCX 模块，带有1个CYP21A1P假基因和1 个CYP21A2基因，其中基因从端粒到着丝粒的方向为RP1-C4A-CYP21A1P-TNXARP2-C4B-CYP21A2-TNXB。也存在单RCCX 模块、三RCCX 模块和四RCCX 模块。大多数三RCCX 模块携带2 个CYP21A1P假基因和1 个CYP21A2基因，但也可能含有2个CYP21A2基因和1个CYP21A1P假基因，并且已经在p.（Gln319*） 致病变异和CYP21A1P/CYP21A2基因嵌合的携带者中发现［8-9］。

由于真假基因序列的高度同源以及RCCX模块的串联重复，且处于重组活性很高的HLAⅢ区域，使得RCCX 模块之间易于发生非等位基因同源重组，主要为不平衡交换和基因转换。前者则可导致CYP21A2基因缺失、重复及形成嵌合基因，后者则导致真假基因间遗传物质的转换，因此CYP21A2基因变异主要包括大的基因重排变异和小的来源于假基因转换变异，非假基因来源的自发变异所占比例很少。在21-OHD 患者中，95%的致病变异是由于真假基因间重组所致。其中，75%是由于假基因上存在的变异通过有丝分裂时微转化事件转移至真基因而致病［10］；20%～25%是由于减数分裂时非等位基因重组，不等交换而导致CYP21A2缺失或形成CYP21A1P/CYP21A2嵌合体。在CYP21A2基因中，只有不到5%的致病性变异不是由基因转化引起的，可能不存在于假基因中［11］。1%～2%的变异来自CYP21A2基因的新发突变［12］。CAH也可以由单亲二倍体引起，但非常罕见［13］。

2 21-OHD分子诊断策略

2.1 21-OHD基因型与表型的相关性

迄今为止，报道了21-OHD相关CYP21A2基因变异1 300余种，其中230种影响人类健康［14］。这230种致病变异中，156 种导致经典型CAH，74 种导致NCCAH。19种变异位于该基因的非编码区，其中4种影响启动子，包括c.-126C>T、c.-113G>A、c.-110T>C及c.-103A>G。据报道［15］，c-126C>T 引起NCCAH。230种变异中，153种是错义突变，可导致各种形式的CAH，而无义和移码变异通常导致经典型CAH。

最常见的变异有10种［15］，包括大片段的基因缺失和转换、8 种CYP21A2与CYP21A1P来源的点突变（p.P30L、I2G、p.I172N、E6 cluster、p.V281L、F306+T、p.Q318X、p.R356W）、外显子3的p.G110fs（8个碱基丢失）。这10 种变异可以解释大部分的临床问题。有些变异不影响蛋白质的合成，被认为是多态性。如D183E 是一种不影响酶活性的基因转换，也存在于CYP21A1P基因中；而其他如K102R、S268T和N493S等只存在于CYP21A2基因中。

总体来说，21-OHD 基因型和表型之间有良好的相关性。如大片段的基因缺失/转换变异、p.Q318X、p.R356W、E6 cluster、Exon3 Del8bp 及I2G 与SW 型有关，导致残存酶活性为0～1%，这些变异为严重致病变异；错义致病变异p.I172N 导致残存酶活性为1%～2%，醛固酮合成接近正常，多与SV 型有关，为中间致病变异；第三组致病变异包括p.V281L、p.P30L、p.P453S、p.R339H、p.R369W、p.I230T 等导致残存酶活性为20%～60%，多与NCCAH 相关，为轻度致病性变异。

由于大多数21-OHD 导致的CAH 患者是复合杂合子，经典型患者携带2 个严重致病变异的等位基因，不携带轻度致病变异。NCCAH 患者可能携带2个轻度的致病变异（25%～50%），或1 个轻度和1 个严重致病变异（50%～75%）。严重致病变异致21-羟化酶活性<1%，但轻度致病变异可有部分酶的合成，活性最高可达正常的50%。有报道显示，在NCCAH患者中，基因型为1 种轻度的致病变异和1 种严重的致病变异的患者，与2 个等位基因均为轻度致病变异的患者相比，其多毛程度和17-OHP 水平（基础值和ACTH激发值）都增高［16-17］。

尽管基因型和表型之间有相对较高的一致性，但携带中间致病变异的患者有可变性。例如，IVS2-13（c.293-13A/C>G）和I172N［p.（Ile173Asn）］可导致不同程度的21-羟化酶活性受损。因此，通常被认为是SV型的患者部分表现为失盐，部分更接近NCCAH［18-19］。研究［20］显示，P30L［p.（Pro31Leu）］与NCCAH及SV型CAH 相关。临床表型与基因型预测一致性分别为100%（SW）、95%（SV）和70%（NCCAH）［21］。

2.2 21-OHD基因分型常用的分子诊断策略

由于CYP21A2基因拷贝数变异的频繁出现，以及大量可能的遗传变异，对CYP21A2等位基因的鉴定相当困难。仅采用Sanger测序无法检出CYP21A2基因大片段缺失，而多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA） 可 检测大片段缺失，对早期诊断和干预有重要意义，且可以通过结合探针的峰高判断是单等位基因的缺失，还是CYP21A2基因的完全缺失，是目前CYP21A2基因缺失诊断的较为可靠的方法［22］。21-OHD最佳的基因分析应该是基于聚合酶链反应的序列分析联合MLPA，有助于检测出多种类型的变异。

由于任何检测均有局限性及CYP21A2基因座具复杂性，这些技术都不能识别所有的变异。应该尽可能进行家系分离研究，这样可鉴别先证者2个被检测到的致病变异是影响2个等位基因（反式构型，trans），还是位于同一个等位基因（顺式构型，cis）［23］。如为cis，尽管CYP21A2基因有2个致病变异，但只有1个等位基因发生变异而另一个等位基因正常，则无临床表现。

3 21-OHD基因分型指导治疗

基因型与表型的特定关系可直接服务于临床诊断，为新生儿筛查及阳性患儿临床分型提供依据；而仅通过生化激素检测，不能预知患儿疾病的严重程度及确定具体的临床分型。同时，21-OHD 基因型-临床表型的对应关系可指导氢化可的松用药剂量，实现更精准的治疗以及预后判定。如基因型预测为SW 型，推荐使用氢化可的松联合氟氢可的松，这样可最大程度避免肾上腺危象，减少高钾低钠血症发生，从而减少住院次数及缩短住院时间；如基因型预测为SV 型，则建议避免使用过量的氟氢可的松，以降低发生医源性高血压的风险。但基因型预测也存在不确定因素，尤其是中间致病变异，此时需结合临床体征、实验室检测以及诊疗过程中的密切随访来指导治疗。

4 21-OHD基因分型指导遗传咨询

21-OHD 属于常染色体隐性遗传性疾病，即只有当2 个等位基因同时发生变异时才会发病。如2 个等位基因存在相同的基因变异，即基因型为纯合子；2个等位基因都有变异，但是在不同的位点，即为复合杂合子型。CYP21A2基因变异虽然种类繁多，但大多数患者基因型为复合杂合子型，临床表现取决于酶活性受损较轻的等位基因［24］。

每个病例的兄弟姐妹都有25%的概率为CAH 患者，50%的概率为无症状携带者。根据1/10 000～1/20 000 的经典型CAH 发病率推算，一般人群中1/50～1/71 是杂合子，中位数为1/60，经典型CAH 的患者有1/120的概率生育患经典型CAH子代。

对于NCCAH，几乎70%的确诊患者是复合杂合子，即携带1个导致经典型CAH 的等位基因和1个导致NCCAH 的等位基因。2 个等位基因中，导致残余酶活性较高的变异决定了表型。这意味着患者为NCCAH，其后代有50%的概率继承经典的CAH等位基因。从理论上讲，NCCAH 患者子代患经典型CAH的风险为1∶250［25］。然而，在2 项对NCCAH 妇女子代的回顾性研究中，其患病风险更高，为1.5%～2.5%［26］。在伴有经典型CAH 和NCCAH 的男性混合组中也发现了类似的风险［27］。

由于CYP21A2变异的高携带率，家庭成员可能携带先症者未检测到的CYP21A2其他变异。因此，在高危亲属中，尽管有已知的家系CYP21A2变异类型，全面筛选CYP21A2变异（通过测序和MLPA 分析）与只分析先症者中检测到的已知的变异类型相比更具优势。

5 结语

分子检测有助于21-OHD 患者的确诊，尤其对于临床疑似而实验室诊断困难者，或诊断不明已用糖皮质激素治疗者。在大多数情况下，疾病表型的严重程度可以通过基因型来预测。基因型与临床表型的相关性可以为患者的短期和长期治疗提供重要的指导；在先症者及父母基因型明确的基础上，可为需要再生育的CAH家庭提供产前诊断。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者贡献/Authors'Contributions

吕拥芬和李嫔共同负责论文的撰写和修改。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

The manuscript was drafted and revised by LÜ Yongfen and LI Pin.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-11

·Accepted：2022-04-27

·Published online：2022-05-28