基于网络药理学探究骨碎补总黄酮治疗类风湿性关节炎的作用机制

刘潇予，陈光耀，吴子彧，金 琦，陶庆文

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院中医风湿病科，免疫炎性疾病北京市重点实验室，北京 100029）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以对称性累积小关节为主要特征的慢性自身免疫性炎性疾病，在世界范围内的发病率约为0.5%～1.0%［1］。RA 的主要病理表现为炎性反应导致滑膜的异常增殖，最终导致滑膜内新生血管的形成，并进一步造成骨侵蚀［2］。未经良好控制的RA常导致关节的损害，并最终导致关节畸形及功能丧失［3］。以甲氨蝶呤为代表性的改善病情的抗风湿药物是现代医学治疗RA 的最常用药物，但胃肠道反应、骨髓抑制、肝功能损害等一系列的不良反应限制了其临床使用［4］。中医药治疗RA 具有副作用小、疗效确切，且能根据患者的临床特点进行针对性的治疗的特点［5］。中药雷公藤提取物雷公藤多苷被多项随机对照试验实验证实对RA 具有良好的改善作用，并被相关指南推荐应用于RA 的临床治疗［6］。从中药中提取有效成分并应用于RA 的临床治疗，成为当今研究的热点。

骨碎补是水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm.的干燥根茎，具有疗伤止痛、补肾强骨的作用，常被应用于风湿相关疾病与骨折的治疗。黄酮类化合物是骨碎补药材中的主要活性成分，而骨碎补总黄酮（total flavonoids of Rhizoma Drynariae，TFRD）被批准应用于骨质疏松的临床治疗。相关研究表明，骨碎补总黄酮对骨折、骨关节炎、链霉素耳毒性及动脉粥样硬化均具有良好的干预作用［7，8］。相关基础研究表明，骨碎补总黄酮对破骨细胞活性、炎性细胞因子、基质金属蛋白酶表达具有良好的抑制作用［9，10］。骨质疏松常伴发类风湿性关节炎，在临床中使用该药物对RA 伴随骨质疏松患者进行治疗时发现，TFRD 能够减轻类风湿性关节炎关节肿胀、疼痛等症状。同时，RA 的骨侵蚀发生与破骨细胞异常激活、炎性细胞因子过度表达、基质金属蛋白酶分泌增加密切相关，故推测TFRD 对RA 具有一定的干预作用。因此，本研究拟通过网络药理学探究其治疗类风湿性关节炎机制，为进一步的实验研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 骨碎补有效黄酮类成分筛选

以“骨碎补”为关键词，在中药系统药理学数据库与分析 平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）进行化学成分的筛选。选取满足口服生物利用度（oral bioavailibility，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 的全部成分，并进一步通过分子结构筛选出骨碎补有效成分中的黄酮类成分。

1.2 骨碎补有效黄酮类成分靶点预测

纳入TCMSP 数据库中全部骨碎补有效黄酮类成分的相关靶点，并通过Unitprot 数据库（https：//www.Uniprot.org/），对靶点简称进行标准化处理。同时，运用Pubchem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查询有效成分的SMILE 标准结构式，并导入SwissTargetPrediction 数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）和STITCH 数 据 库（http：//stitch.embl.de/）进行靶点预测，以置信度Confidence＞0.4 为条件，将满足条件的靶点纳入后续研究。

1.3 RA 相关疾病靶点预测

本研究采用GenBank 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET 数据库（https：//www.disgenet.org/）和在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：//omim.org/）搜索RA 疾病相关靶点。以“rheumatoid arthritis”为关键词，在上述数据库中搜索疾病相关基因并删除重复基因。并绘制药物靶点-疾病基因的Venn 图。

1.4 蛋白互作网络的构建与核心蛋白的筛选

本 研 究 通 过STRING 数 据 库（https：//stringdb.org/）获得药物-疾病共同靶点的蛋白互作网络关系。将上述交集蛋白靶点导入STRING 数据库，物种设置为“Homo sapiens”，筛选出蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）评分高于0.9 的蛋白关系，并导入Cytoscape 3.8.2 构建PPI 网络图。使用Cytoscape 3.8.2 中Analyze Network 功能对该PPI 网络关系进行拓扑分析，选取Degree 大于平均值的蛋白作为核心蛋白，并生成核心蛋白网络图。

1.5 骨碎补总黄酮治疗RA 调控网络的构建

将得到的骨碎补总黄酮有效成分、骨碎补总黄酮成分靶点和骨碎补总黄酮-RA 交集基因及其相互关系导入Cytoscape 3.8.2，构建骨碎补总黄酮-作用靶点-RA 的调控网络。

1.6 GO 基因富集分析

将骨碎补总黄酮治疗RA 的基因靶点导入DAVID enrichment 数 据 库（https：//david. ncifcrf.gov/），物种选择“H. sapiens”，对作用靶点进行基因富集分析，预测基因的功能分布。按照P值从小到大排列，对生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）和细胞成分（cellular component）3 个模块进行排序，各筛选出排名前10 的生物过程，统计富集基因数，并使用Graphpad Prism 8 绘制条形图。

1.7 KEGG 通路富集分析

对药物-疾病交集基因进行KEGG 通路富集分析，得到可能受活性成分调控的重要通路。筛选出P＜0.05 的前20 条通路，并进行可视化分析。

1.8 活性成分与核心靶点的分子对接

选取骨碎补总黄酮中关键成分以及筛选出的核心蛋白进行分子对接。在RCSB PDB 数据库（http：//www1.rcsb.org/）下载核心蛋白的结构文件，并保存为pdb 格式；在PubChem 数据库下载骨碎补总黄酮关键成分的结构，并通过Open Babel GUI 将关键成分结构转换为mol2 格式。运用AutoDockTools 1.5.6 对骨碎补总黄酮关键成分与核心蛋白进行分子对接，并用Pymol 对分子对接结果进行可视化做图。

2 结果

2.1 骨碎补有效黄酮类成分筛选

以“骨碎补”为关键词，在TCMSP 数据库共搜索到71 种骨碎补有效成分，其中满足OB≥30%，OL≥0.18 的骨碎补黄酮类成分共有10 种，包括木犀草素、槲皮素、山奈酚、金鱼草素等。骨碎补有效黄酮类成分的具体信息见表1。

表1 骨碎补有效黄酮类成分表Tab 1 Components of effective flavonoids of Rhizoma Drynariae

2.2 骨碎补有效黄酮类成分靶点预测

TCMSP 检索得到77 个骨碎补有效黄酮类成分的相关靶点。以置信度＞0.4 为条件，分别在SwissTargetPrediction 数据库和STITCH 数据库检索得到61 个和108 个相关靶点。删除重复靶点，总共得到210 个有效成分对应的靶点。

2.3 RA 疾病相关基因预测

以“rheumatoid arthritis”为关键词，在GenBank数据库查询到1 263 个相关基因，在GeneCard 数据库查询到898 个相关基因（相关度≥4），在DisGeNET 数据库查询到867 个相关基因（Score≥0.05），在OMIM 数据库中查询到42 个相关基因。删去重复基因，共有2 009 个与RA 相关的基因。将RA 疾病相关基因与骨碎补有效黄酮类成分相关靶点取交集，得到123 个交集基因，交集基因的Venn 图。见图1。

图1 骨碎补总黄酮-RA 交集基因Venn 图Fig 1 Venn diagram of intersection genes of total flavonoids of Rhizoma Drynariae（TFRD）and rheumatoid arthritis（RA）

2.4 骨碎补总黄酮治疗RA 的PPI 网络与核心蛋白

本研究使用STRING 数据库，筛选出互作评分大于0.9 的蛋白关系构建骨碎补总黄酮治疗RA 的PPI 网络，并导入Cytoscape 3.8.2 进行可视化（图2A）。网络中包括108 个功能蛋白，541 个相互作用关系，平均节点度为8.8，局部聚类系数为0.478，预期边数值为112。PPI 网络中连接靶点数目（Degree）与蛋白核心程度为正相关，选取Degree 大于平均值的蛋白作为核心蛋白，并生成核心蛋白网络图，节点越大，颜色越深，则该蛋白的连接靶点越多（图2B）。PPI 网络中核心蛋白连接靶点数目，见图3。与RA 密切相关的蛋白包括STAT3、MAPK1、MAPK3、AKT1、MAPK8、IL-6、TNF、MAPK14、IL-4、IL-2、VEGFA、IL-1β、MAPK9 等，主要涉及炎性细胞因子（肿瘤坏死因子类、白介素类）、细胞因子信号转导途径（STAT 与MAPK 信号通路）、新生血管形成等途径。

图2 PPI 网络及核心蛋白网络图Fig 2 PPI network and core protein network

图3 PPI 网络中核心蛋白连接靶点数目条形图Fig 3 Bar graph of the number of core protein junction targets in the PPI network

2.5 骨碎补总黄酮治疗RA 调控网络

本研究主要筛选出10 种骨碎补总黄酮活性成分，其中木犀草素、柚皮素、山奈酚等7 种活性成分参与了RA 调控网络，使用Cytoscape 3.8.2 构建药物-有效成分-作用靶点-疾病可视化调控网络。见图4。网络中共有132 个节点（123 个作用靶点，7 个活性成分，1 个疾病名称，1 个药物名称），253 条连接。图中蓝色长方形表示骨碎补总黄酮，红色六边形表示类风湿性关节炎，绿色椭圆形表示骨碎补总黄酮活性成分，粉红色“V”形表示药物-疾病共同靶点，连线表示药物、有效成分、作用靶点、疾病之间的相互关系。骨碎补总黄酮活性成分的节点大小反映节点连接靶点的数目，节点越大，表示该节点在网络中处于越核心的位置。结果显示，骨碎补总黄酮活性成分可调控多个作用靶点，其中木犀草素、柚皮素与靶点的连接数目最多，分别为125 和29个，提示这两种物质可能是骨碎补总黄酮治疗RA的关键成分。

图4 药物-有效成分-作用靶点-疾病调控网络Fig 4 Regulatory network of drug-active ingredient-target-disease

2.6 GO 基因富集分析

使用DAVID Enrichment 数据库对骨碎补总黄酮治疗RA 的靶点进行GO 基因富集分析，根据Pvalue 值从小到大筛选出排名前10 的生物过程。见图5。GO 富集分析显示，在生物过程方面，作用靶点涉及转录的正调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱpromoter，positive regulation of transcription）、基因表达的正调控（positive regulation of gene expression）、凋亡过程的调控及信号通路（negative regulation of apoptotic process，extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand）、炎症反应（inflammatory response）等。在细胞成分方面，作用靶点涉及胞质（cytosol）、细胞外区域（extracellular region）、蛋白质复合体（protein complex）、细胞核（nucleoplasm，nucleus）、转录因子复合体（transcription factor complex）等。在分子功能方面，作用靶点涉及酶结合（enzyme binding）、蛋白结合（protein binding）、转录因子结合及转录激活因子活性（transcription factor binding，transcriptional activator activity）、RNA 聚 合 酶Ⅱ转录因子活性（RNA polymerase Ⅱtranscription factor activity）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、细胞因子活性（cytokine activity）等。

图5 BP、MF、CC 各排名前10 的GO 富集分析结果Fig 5 Top 10 GO enrichment analysis results of biological process（BP），molecular function（MF）and cellular component（CC）

2.7 KEGG 通路富集分析

对上述骨碎补总黄酮-RA 交集基因进行KEGG 通路富集分析，得到显著富集的相关通路164 条，按富集显著度从小到大排列，筛选出前20 条KEGG 通路。见图6。图中横坐标表示该通路所富集的基因与通路基因总数的比率，气泡大小表示富集基因数量，气泡颜色表示P值。结合相关文献分析，提 示PI3K/AKT 通 路［11］、IL-17 通 路［12］、TNF-α通路［13］、T 细胞受体转导通路［14］及Th17 细胞分化调节通路［15］可能在骨碎补总黄酮治疗类风湿性关节炎中发挥重要作用。将以上通路与骨碎补总黄酮-RA 交集基因靶点构建网络。见图7。

图6 KEGG 通路富集Fig 6 KEGG pathway enrichment

图7 作用靶点-关键通路图Fig 7 Target-key pathway diagram

2.8 分子对接验证

为了评估骨碎补总黄酮中关键成分与关键靶点的的结合亲和力，使用AutodockTools 进行分子对接。选取骨碎补总黄酮治疗RA 调控网络中靶点连接数目最多的木犀草素和柚皮素作为分子对接配体，选取蛋白互作网络中关键蛋白STAT3 和PI3K/AKT 通路中的重要调控蛋白AKT1、PI3K 作为受体进行分子对接。木犀草素与AKT1、PI3K 和STAT3 的 结 合 能 分 别 为-5.45、-6.95 和-6.85 kcal/mol，柚皮素与AKT1、PI3K 和STAT3 的结合能 分 别 为-3.37、-4.38 和-4.13 kcal/mol。见 表2。提示较之于提示柚皮素，木犀草素与关键靶点AKT1、PI3K 和STAT3 的结合能力更强，提示其更有可能影响其结构，进而影响其磷酸化，从而调控STAT3 及PI3K/AKT 信 号 通 路。AKT1、PI3K 和STAT3 和骨碎补总黄酮关键成分的分子对接模式图。见图8。

表2 骨碎补总黄酮关键成分与关键靶点的的结合能（kcal/mol）Tab 2 Binding energy of key components and key targets of total flavonoids of Rhizoma Drynariae

图8 骨碎补总黄酮关键成分和AKT1、PI3K 和STAT3 的分子对接模式图Fig 8 Molecular docking patterns of key components of total flavonoids of Rhizoma Drynariae and AKT1，PI3K and STAT3

3 讨论

既往研究表明，黄酮类成分是中医药治疗RA的关键有效成分，可能与其抗炎、抗氧化等机制密切相关［16，17］。本研究对骨碎补总黄酮治疗RA 的有效成分筛选并进行分析，提示木犀草素与柚皮素可能是其治疗RA 的关键成分。在既往研究中发现，木犀草素被证实能够通过抑制滑膜的炎性细胞因子表达、基质水解酶表达及炎性因子相关通路，进而发挥对RA 的治疗作用［18］。柚皮素不仅具有较强的抗炎作用，同时还可以有效改善甲氨蝶呤治疗RA 过程中造成的肝脏损害［19］。提示骨碎补总黄酮不仅具有潜在的治疗RA 的作用，同时与西药联用可能具有减毒增效的机制，值得进一步进行探究。

细胞因子是由免疫细胞（单核细胞、巨噬细胞、T 细胞、B 细胞、NK 细胞等）和某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子与细胞表面受体结合，并进一步通过调控转录等途径启动复杂的细胞内分子间的相互作用。RA 作为一种自身免疫性炎性疾病，多种细胞因子参与其相关疾病的过程。研究表明RA 伴随着转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）水平显著升高，并通过激活炎症相关基因表达，在炎症发展过程中起重要调控作用［20］。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是生物体内重要的信号蛋白之一，参与了细胞因子与受体结合后调控转录的进程，对生物的生长、分化、应激适应和炎症反应具有重要的调控作用［21］。肿瘤坏死因子-α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β 均为参与炎性反应与免疫应答的重要细胞因子，能够刺激滑膜的炎性反应，并进一步引起滑膜的异常增殖［22］。TNF-α、IL-6、IL-1β 相关单克隆抗体被应用于RA 及幼年特发性关节炎的治疗，并显示出良好的临床效果［23］。IL-2 和IL-4 分别为Th1 及Th2 细胞分泌的特征性细胞因子，对免疫系统具有重要调节作用［22］。研究表明，小剂量IL-2可以通过调节Th17/Treg 平衡，发挥对RA 的治疗作 用［24］。PPI 结 果 提 示，细 胞 因 子TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6 是骨碎补总黄酮干预RA 的关键靶点。同时MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14 及STAT3 在骨碎补总黄酮干预RA 的过程中发挥了重要作用，其中STAT3 是最为核心的调控靶点。Caspase3 及血管内皮生长因子提示骨碎补总黄酮可能参与了RA 的细胞凋亡过程及滑膜新生血管的进程［25，26］。

KEGG 富集 分析表明，PI3K/AKT 通路、IL-17通路、TNF-α 通路、T 细胞受体转导通路及Th17 细胞分化调节通路可能在骨碎补总黄酮治疗类风湿性关节炎中发挥重要作用。共35 个骨碎补总黄酮-RA 交集基因参与了PI3K/AKT 通路的调节，同时PI3K/AKT 异常活化可以激活NF-κB，进而促进TNF-α、IL-17、IL-6 细胞因子的转录，进而激活IL-17 通路、TNF-α 通路、T 细胞受体转导通路及Th17细胞分化调节通路。提示PI3K/AKT 通路可能是骨碎补总黄酮治疗RA 的最为重要的调控通路。在进一步的分子对接实验中将骨碎补总黄酮治疗RA最为关键的成分木犀草素与柚皮素，与关键靶点选用PPI 中关键蛋白STAT3，PI3K/AKT 通路中重要的调控蛋白PI3K、AKT1 进行分子对接。分子对接结果显示木犀草素能够更好与这些靶点相结合，提示其可能通过改变分子结构从而对STAT3、PI3K、AKT 等的相关磷酸化过程进行调控，进一步影响其下游功能。

综上，骨碎补总黄酮可能通过调控炎性相关细胞因子及相关传导途径，从而抑制RA 的炎性反应，而PI3K/AKT 通路可能是骨碎补总黄酮发挥治疗RA 的重要途径。木犀草素是骨碎补总黄酮治疗RA 的关键分子，并可能通过抑制相关核心蛋白的构象，进而调控磷酸化发挥下游途径作用。未来本课题组将通过进一步实验研究进行验证，为骨碎补总黄酮治疗RA 提供相关依据并为临床应用提供基础。

作者贡献度说明：

刘潇予：设计并执行研究方案，采集与分析数据，绘制图表，撰写论文，最终版本修订；陈光耀：提出研究思路，采集与分析数据，撰写论文，最终版本修订；吴子彧、金琦：分析数据，绘制图表，参与论文修订；陶庆文：监督与指导，最终版本审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。