基于靶基因捕获测序法对海南汉族寻常性银屑病与GC 基因关系的研究

刘 琨，刘军麟，袁丞达，陆春婉，殷 梅

（1. 海南医学院第二附属医院皮肤性病科，海南 海口 570311；2. 杭州市中医院皮肤性病科，浙江 杭州 310005；3. 海南医学院第二附属医院体检科，海南 海口 570311）

银屑病是一种免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病，其发病由T 淋巴细胞介导，且受环境和遗传因素共同影响。既往研究表明维生素D及其衍生物可通过多种途径对银屑病皮损的治疗产生作用。此外，银屑病患者的血清1，25（OH）2D3水平比对照组显著降低，且在银屑病关节炎患者中，血清1，25（OH）2D3水平与疾病活动度呈负相关［1-3］。血清25（OH）D3水平通常是评价人体内维生素D3含量高低的指标［4］，而血清25（OH）D3水平取决于维生素D 结合蛋白（vitamin D binding protein，VDBP）的浓度以及维生素D3与VDBP 亲和力。VDBP 由GC 基因编码，该基因位于染色体4q13.3，长约64 kb，包含15 个外显子。虽有报道GC 基因及其单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与癌症、肥胖、代谢综合征或其他疾病具有相关性［5-8］，但目前尚未发现有明确报道表明GC 基因与银屑病有明显相关性。

基于上述情况，本研究在相对隔离的海南汉族寻常性银屑病及正常人群中采用二代测序技术对GC 基因及其上、下游各2 kb 区域进行重测序，获取该区域内的所有SNP 并进行基于SNP 的关联分析，以期全面、深入揭示GC 基因与银屑病的关系。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

2018 年3 月～2020 年2 月在海南医学院第二附属医院门诊及病房101 例海南籍汉族寻常性银屑病患者，所有患者符合寻常性银屑病诊断标准［9］，男、女性患者分别为65 例、36 例，年龄18～82 岁，平均（45.31±14.05）岁。另从海南医学院第二附属医院体检中心收集79 例海南籍汉族健康人为正常对照，男、女性分别为47 例、32 例，年龄21～78 岁，平均（41.76±12.86）岁。将自祖父辈起为海南籍且无明确的岛外迁入史作为海南籍的认定标准。两组人群间及人群内均无亲缘关系，且对照组人群均无银屑病家族史。年龄、性别在两组间均无统计学差异（分别为t=1.745，P=0.083；χ2=0.446，P=0.504）。

本研究已通过海南医学院第二附属医院医学伦理委员会审核，研究对象均填写基本情况表并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 靶基因捕获测序 对两组样本的GC 基因及其上、下游各2 kb 区域进行全长测序，步骤如下：（1）样 本DNA 质 量 检 测；（2）DNA 片 段 化；（3）末端修复；（4）3'端加上单个腺苷酸“A”；（5）连接测序接头；（6）文库片段筛选；（7）扩增文库；（8）目的区域芯片杂交；（9）杂交文库清洗及纯化；（10）PCR 扩增DNA 文库；（11）文库的质量检测；（12）上机测序。该检测由上海天昊生物科技有限公司完成。

1.2.2 统计分析 利用Hardy-Weinberg 检验在对照组中对所有SNP 进行检验。入选SNP 标准如下：（1）对 照 组Hardy-Weinberg 检 验 的P值 大 于0.05；（2）最小等位基因频率＞0.01。

采用PLINK 2.00 软件在共显性模型（以正常纯合为参照）、显性模型（低频率的等位基因为显性）、隐性模型（低频率的等位基因为隐性）及等位基因模型等4 种遗传模式下进行关联分析。使用Bonferroni 法和错误发现率法（false discovery rate，FDR）进行校正。

1.2.3 生物信息学分析 采用SIFT Score 软件预测氨基酸改变是否影响基因功能，如SIFT 值＜0.05则表明该变异可严重影响蛋白功能。采用SIFT Score Pred 软件预测其致病性，D 为有害，T 为良性。

2 结果

本研究通过对79 例健康对照和101 例银屑病病例中的GC 基因及其上、下游各2 kb 进行全长测序，共测得94 个SNP。按上述标准筛选出93 个SNP 进行基于SNP 的关联分析。

2.1 基于SNP 的关联分析

对筛选出的93 个SNP 在4 种遗传模式下进行 关 联 分 析（图1～4），有21 个SNP 在 至 少1 种遗传模式下有统计学意义（P值＜0.05）。这些SNP 的OR值 为0.289～2.295，95%CI为0.048～12.670（表1）。 这21 个SNP 中，16 个（rs1565 572、rs16845007、rs16846912、rs222009、rs222010、rs222035、 rs222040、 rs2276460、 rs2282678、rs3755967、 rs705120、 rs705121、 rs73827381、rs73827382、rs7668653、rs844806）位 于 内 含 子区，3 个（rs16847118、rs72649506 和rs72649508）位于非翻译区域（untranslational region，UTR），2个（rs4588 和rs4752）位于外显子区。

图1 共显性模型的卡方检验曼哈顿图Fig 1 Manhattan plot of Chi square test based on codominant mode

图2 显性遗传模型的卡方检验曼哈顿图Fig 2 Manhattan plot of Chi square test based on dominant mode

图3 隐性遗传模型的卡方检验曼哈顿图Fig 3 Manhattan plot of Chi square test based on recessive mode

图4 等位基因模型的卡方检验曼哈顿图Fig 4 Manhattan plot of Chi square test based on allelic mode

表1 有统计学差异的21 个SNP 的关联分析结果（卡方检验）Tab 1 Association analyses results of 21 SNPs with statistical differences（Chi square test）

续表

2.2 生物信息学分析

位于外显子11 的rs4588G＞T 为非同义突变，可导致苏氨酸转换为赖氨酸（Thr→Lys），SIFT Score 为0.481、SIFT Score Pred 为T，而位于外显子8 的rs4752A＞G 未导致氨基酸的改变，为同义突变。

3 讨论

GC 基因经转录、修饰、翻译后合成分布在3 个结构域上，由458 个氨基酸组成的VDBP。不同领域的学者均认为GC 基因与体内维生素D 水平及活性显著相关，是合成活性维生素D 并发挥其生物学功能的关键基因。本研究旨在SNP 的层面探索GC基因与寻常性银屑病的关系。

SNP 可位于基因的任何位置，其中位于外显子区域的SNP 称为编码SNP，编码SNP 发生变异存在两种形式。一是同义突变，即碱基发生变异，但翻译的氨基酸无变化。本研究中发现的rs4752 虽然出现了A→G 变异，但其翻译的仍为半胱氨酸（Cys），并不引起基因功能改变。虽然生物信息学分析提示该位点翻译的氨基酸未发生改变，但在本研究中4 种不同遗传模式的统计学分析中提示其在共显性、显性及等位基因3 种遗传模式下均与银屑病易感性相关（分别为P=0.012、P=0.009、P=0.022）。这可能和同义突变虽然不能引起氨基酸的变化，但可以影响信使RNA 的剪切、稳定性、结构相关［10］，这些变化均可对蛋白质功能产生影响，导致疾病的发生、发展，亦可作为药物干预靶点。同义突变导致疾病发生的另一种可能：虽然部分同义突变并未影响RNA 剪切，也不影响信使RNA 和蛋白质的表达，但是却改变了合成蛋白的折叠结构，从而影响了基因功能，据推测这可能是变异后的密码子是罕见密码子的结果［11］。另一种是非同义突变，即SNP 导致了氨基酸改变，从而很可能导致基因功能改变。本研究发现的rs4588G＞T 在共显性模型中与银屑病易感性相关（P=0.028），且生物信息学分析提示rs4588G＞T 会将苏氨酸错译为赖氨酸。本研究的前期工作提示该SNP 的变异会导致VDBP 转变为GC2 型，且GC2 与25（OH）D3的亲和力下降［12］。这提示在生物学功能上，GC 基因的不同亚型可能会影响维生素D 相关信号在组织或细胞水平上的传递。本研究的生物信息学分析结果提 示 该SNP 的SIFT Score 为0.481，SIFT Score Pred 为T，是良性突变。在文献检索中我们虽未发现rs4588 和银屑病关联，但有研究结果提示除了与人体内维生素D 水平显著相关外，其与结直肠癌的发病（OR=2.34，95%CI=1.25～4.37）及2 型糖尿病发病风险升高（OR=8.9，95%CI=1.89～41.99，P＜0.001）均 具 有 相 关 性［5，6］。此 外，也 有 研 究 表 明rs4588 仅与血清维生素D 水平基础值相关（P=7.86×10-7），而与补充维生素D 后的血清维生素D水平变化无关（P=0.15）［13］。

本次研究尚发现位于内含子区的16 个易感SNP，其中11 个SNP 未见与疾病具有相关性的报道（rs1565572、rs16845007、rs222009、rs222010、rs2276460、 rs2282678、 rs705121、 rs73827381、rs73827382、rs7668653 及rs844806），其余5 个SNP（rs222040、 rs16846912、 rs222035、 rs3755967、rs705120）与其他疾病或血清25（OH）D3水平存在相关性。

一项来自挪威的578 对新生儿母子（女）参与的研究表明胎儿的rs222040 是新生儿脐带血中25（OH）D3水平相关性最强的预测因子（P＜0.001）。该研究进一步证实除了肝脏外，胎盘中也可表达GC 基因，但母体和胎儿中的VDBP 是否参与胎盘维生素D 的转运尚有待进一步验证［14］。在有2 207名高加索妇女参与的有关血清25（OH）D3与维生素D 代谢通路基因的相关研究中也表明rs222040 与血清25（OH）D3基础值高度相关（P=1.59×10-4）［13］。

来自上海的3 108 人参与的研究提示，单倍型rs842999/rs705120/rs222040/rs4588/rs7041/rs104 88854 GAGTAC 是导致25（OH）D3水平降低的风险因素（P=2.0×10-5），而低水平的25（OH）D3也与VDBP 水平降低显著相关。据此，研究者推测GC基因的变异导致VDBP 水平降低进而引起血清25（OH）D3水平降低，但他们认为这一结果由该单倍型中内含子区域的SNP（包括rs222040）导致的可能性不大，而非同义突变的rs4588 可能是其潜在的致病风险位点［15］。此外，一项关于家族性哮喘及维生素D 代谢信号通路的相关研究表明，rs222040 与血清总IgE 水平升高相关而与维生素D 水平不相关（PIgE=0.016，P25（OH）D3=0.382）［7］。这 提 示 本 研 究 中发现的部分变异也可能并不直接对寻常性银屑病发病产生影响，而只是一个标记位点，它和真正的寻常性银屑病的易感位点间存在强连锁不平衡。

2010 年1 篇 载 于Lancet 上 的 文 献 提 示，rs3 755967 与体内低水平的25（OH）D3水平显著相关（P=2.42×10-75）［16］。此后多名学者对rs3755967 进行了进一步研究。其中一项浙江舟山2 658 名孕妇参与的GC 基因多态性与孕妇体内25（OH）D3水平及补充维生素D 后25（OH）D3水平变化的关联研究表明［17］，rs3755967 在整个妊娠周期 中均与 较低的25（OH）D3水平相关（P≤0.0001），且在孕早期补充维生素D 后，不同的基因型（CT/TT）与体内25（OH）D3水平上升差异明显相关（P值均＜0.0001）。该研究还发现rs3755967 和rs7041 呈高度LD（r2＞0.96）。基于该关联分析结果，研究者认为是rs4588和rs7041 这两种非同义突变合成的不同亚型的VDBP 对维生素D 亲和力的差异导致了妊娠周期中25（OH）D3水平不同及补充维生素D 后体内25（OH）D3上升的差异变化，而非rs375596 对血清游离25（OH）D3水平有直接影响。

一项美国团队利用上海乳腺癌研究中心Ⅰ期及Ⅱ期数据的GWAS 研究表明rs3755967 与中国女性乳腺癌风险无明显相关性［18］，而一项来自国内关于中国女性乳腺癌的分层研究则提示，rs3755967 的CT 基因型与乳腺癌低风险显著相关（OR=0.77，95%CI=0.62～0.96，P=0.021）。结合既往的流行病学调查，该团队认为GC 基因通过影响体内活性25（OH）D3水平调节细胞的增殖和凋亡，在乳腺细胞中，低水平的25（OH）D3可能会削弱酶的活性和减少1，25（OH）2D3的生成来调节这一作用。此外，该研究尚发现rs17467825、rs2298850、rs3755967 和rs2282679 高度连锁不平衡（r2=1.0、0.9、1.0），结合相关文献，他们认为rs2282679 与肿瘤风险相关，而rs3355967 位于内含子区域，可能参与基因表达调控或影响氨基酸修饰，确切原因需要进一步探索［8］。另有研究显示，VDBP 还可能通过非维生素D 信号通路直接参与包括趋化作用和巨噬细胞活化在内的抗肿瘤过程。该研究认为VDBP 参与激活巨噬细胞分子，并通过葡萄糖苷酶去糖基化形成VDBP-巨噬细胞激活因子，增强促凋亡酶的活性，最终通过JAK1/2 和p38 通路诱导细胞凋亡，抑制肿瘤发展［19］。

一项有79 366 名参与者的国际研究证实，欧洲和北美人群中rs3755967 与血清25（OH）D3水平降低显著相关（P=4.7×10-343）［20］，这一结论与德国一项8 417 名老人参与的研究结果相似［21］。而另一项相关研究提示rs3755967 与阿拉伯人及南亚人的血清25（OH）D3低水平显著相关，与东南亚人的血清25（OH）D3水平不相关［22］。这提示rs3355967 可能在不同种族间的生物学效应不尽相同，亦有可能由于被检测人群的生活环境不同，导致结果有所差异。

此外，rs222035、rs222040 及rs705120 被证实分别与血清游离25（OH）D3水平、家族性哮喘及血清25（OH）D3基 线 水 平 存 在 相 关 性，且rs7041、rs222035 和 rs842999 高 度 连 锁 不 平 衡（r2＞0.92）［7，13，23，24］。

本研究尚发现3 个位于UTR 的SNP（rs1684 7118、rs72649506、rs72649508），经检索，均未发现与银屑病相关的报道，尚需进一步研究。

总之，本研究揭示，在海南籍汉族人群中，有21个与寻常性银屑病有关的易感SNP，位于GC 基因的内含子、外显子及UTR，其中外显子上的SNP 可导致蛋白改变，且有较大可能影响基因功能。这表明GC 基因与寻常性银屑病的易感性存在关联，但因本研究样本量较小，尚待在大样本量和/或其他人群中进行更大规模的探索，并进而通过功能学研究证实。

作者贡献度说明：

刘琨：并列第一作者，负责病例标本收集、实验操作及论文初稿写作等；刘军麟：并列第一作者，负责研究设计、文章撰写指导及修改工作；袁丞达：负责数据处理，文章修改；陆春婉：并列通讯作者，负责病例和对照标本收集、实验操作；殷梅：通讯作者，对照样本收集、文献检索及文章内容审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。