糖尿病导致内皮祖细胞功能障碍的机制及治疗潜力

张 肖，黎 瑶

0 引言

随着我国经济的高速发展，人们的生活方式发生了巨大变化，高糖、高脂的不健康饮食和运动量的缺乏使我国的2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)发病率逐步上升。有报道，中国有1.139亿成人糖尿病患者，占全球糖尿病患者的24%，糖尿病对我国甚至全球的医疗系统都造成了巨大的医疗负担[1]。随着糖尿病病程的增加，糖尿病急慢性并发症、高脂血症及代谢综合征的出现显著降低了患者的生活质量。糖尿病所伴随的高糖毒性、胰岛素抵抗及炎症介质的增加损害了血管内皮细胞的数量及功能，提高了心血管疾病(Cardiovascular diseases，CVD)的发病风险[2]。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)具有促进缺血组织的血管再生及血管内皮修复的功能[3]。近年来，EPCs作为一项标志物频繁地与心血管不良事件及死亡率联系在一起，越来越多的研究表明，糖尿病机体EPCs水平的下降，预示着心血管不良事件的发生率及死亡风险增加，同时与糖尿病微血管并发症的发生及恶化密切相关[4]。EPCs的发现成为突破糖尿病长期慢性血管并发症的窗口，使逆转和改善微血管障碍及动脉粥样硬化成为可能。本文就糖尿病环境导致EPCs功能障碍的机制进行综述，并回顾通过改善EPCs功能障碍使糖尿病血管并发症得到受益的研究，探讨EPCs逆转糖尿病血管病变的治疗潜力。

1 EPCs的概念

1997年，Asahara等[3]从外周血中分离出表达CD34+表面标记的单核细胞，并证实了这些细胞在体外可以促进缺血组织的血管再生。这一研究颠覆了既往研究认为血管生成只发生在早期胚胎中的认知，开创了研究内皮祖细胞领域的先河。目前有2种方法研究内皮祖细胞，第1种基于不同细胞表面标记的流式细胞分析，EPCs通常被量化为表达CD34+和血管内皮生长因子受体 2(Vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR2)的单核细胞百分比[5]；第2种是通过特定底物的培养基在体外细胞培养分离的方法，Hur等[6]将单核细胞从外周血中分离后，用内皮细胞培养基(EGM-2 BulletKi)重悬培养成2种EPCs，分为早期和晚期EPCs，早期的EPCs又称为髓样血管生成细胞(Myeloid angiogenic cells，MACS)，主要通过分泌促血管生成细胞因子来促进新生血管的形成，主要包括血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)和粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)等，这些细胞因子有助于招募常驻的成熟内皮细胞并诱导其增殖和存活。晚期EPCs又称为内皮集落形成细胞(Endothelial colony forming cells，ECFCs)，ECFCs通过提供足够数量的内皮细胞直接促进新生血管的生成。EPCs主要来自骨髓，外周血中的EPCs数量较少，当机体处于缺血、缺氧的环境中时，EPCs分泌动员因子如VEGF、基质细胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)等激活内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)通路，通过释放基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)来促进EPCs的动员、迁移，修复血管内皮损伤，促进新生血管的形成；而糖尿病的慢性高糖暴露、胰岛素抵抗、低度全身炎症反应和氧化应激阻碍了血管再生细胞运输，增殖到外周，造成机体的血管损伤与修复的失衡，这一过程称为再生细胞耗竭[7]。

2 糖尿病导致EPCs功能障碍的机制

糖尿病最显著的特征是胰岛素抵抗及高血糖，慢性的高糖暴露导致祖细胞的增殖、分化及迁徙能力受损，同时使线粒体活性氧(Reactive oxygen species，ROS)生成增加，导致eNOS 的表达和活性降低[8]。一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一种血管扩张剂，被证实具有抗炎、抗动脉粥样硬化及介导血管生成的作用，NO的信号通路障碍导致内皮功能障碍，加速动脉粥样硬化及糖尿病血管并发症的发生[9-10]，而高糖环境导致的EPCs数量减少和功能损伤主要机制是MMP-9活性降低，eNOS脱偶联，释放受阻，从而导致NO生成减少[11]。EPCs分泌的SDF-1、VEGF促进了循环内皮干细胞的趋化与动员，在血管内皮细胞分化、成熟中发挥了重要作用[12]。除此之外，EPCs还通过MMP-9实现动员，其主要机制是通过释放可溶性Kit配体(Soluble kit ligand，SKitL)，将干细胞与祖细胞从静止状态转变为增殖状态[13]，进而迁移到损伤的血管内皮，促进内皮修复及血管再生。研究发现，在糖尿病小鼠模型中，VEGF和SDF-1的释放受到抑制，使用胰岛素治疗后可以恢复两者的释放，并提高了eNOS和MMP-9的活性，因此胰岛素治疗主要通过VEGF/eNOS相关通路促进了代偿性新生血管的形成[14]。Terenzi等[15]利用祖细胞在成熟过程中随着氧化应激作用的增加而自身高醛脱氢酶 (High aldehyde dehydrogenase，ALDH) 活性逐渐降低的原理，结合细胞表面标记分析，发现2型糖尿病与健康对照者相比,表达造血和内皮祖细胞表型的细胞显著减少，并且表达促炎M1表型的原始粒细胞增加，抗炎M2表型的循环单核细胞减少，表明糖尿病环境引起了机体全身的低度炎症反应。

3 EPCs的治疗潜力

3.1 EPCs移植 EPCs促进毛细血管再生及侧支循环重塑使人们开始探索EPCs移植对于治疗缺血性疾病的可行性。Tanaka等[16]使用自体G-CSF促进了外周血中CD34+细胞的动员，在18周时发现糖尿病患者足部溃疡伤口闭合，足底深动脉的血管灌注及血管分布增加。Yazdanyar等[17]将健康人骨髓中的CD34+细胞分离后注射到糖尿病视网膜病变小鼠模型玻璃体内，4周后发现CD34+细胞快速迁徙整合到受损的视网膜毛细血管，使视网膜毛细血管的密度增加。但这仅证实祖细胞移植疗法具有一定的安全性与可行性，仍有较多临床研究发现，无论肌注、动脉内注射，祖细胞移植疗法用于治疗心肌缺血、外周动脉缺血等疾病的效果未达预期[18]。可能机制为糖尿病患者机体的外周血中EPCs数量减少、衰老加快、迁徙和归巢功能受损，总之，祖细胞数量和质量的难控性限制了EPCs移植的临床应用及疗效。在一项大型的随机、双盲、安慰剂对照试验中，将骨髓单核细胞(Bone marrow mononuclear cells， BMMNCs)输注到160例下肢严重缺血患者股总动脉内，结果实验组和对照组在截肢率上并没有发现显著差异[19]。因此，逆转高糖、氧化应激导致祖细胞的功能障碍和衰老是祖细胞移植必须解决的难题。研究发现，高表达核因子NF-E2相关因子(Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)的脂肪干细胞 (Adipose-derived stem cell，ADSC) 衍生的外泌体与祖细胞共同培养后可以抑制 ROS、IL-6促炎因子的形成来减缓高糖导致祖细胞的衰老加速，并且将EPCs与高表达Nrf2的ADSC外泌体联合治疗糖尿病小鼠伤口模型时，发现伤口处肉芽组织增生显著，微血管生成增加，证实了ADSC衍生的外泌体促进了祖细胞增殖，高表达的Nrf2加强了高糖环境下对祖细胞的保护作用[20]。除此之外，自体EPCs功能受损还与活性氧的清除减少紧密相关，糖尿病患者体内的抗氧化酶如锰超氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase，MnSOD)的表达降低，有研究表明，用姜黄素处理后的EPCs自体移植到糖尿病小鼠伤口上可以加速伤口的愈合，姜黄素通过提高MnSOD的表达和活性来逆转糖尿病导致的EPCs功能障碍[21]。Tanaka等[22]研究出一种用于培养功能障碍祖细胞的体外培养系统，称为质量-数量培养系统(Quality-quantity control culture，QQc)，将糖尿病患者的外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PbMNCs)进行体外培养后再移植到糖尿病小鼠伤口模型中，发现培养后的PbMNCs表现高血管生成能力，抗炎相关基因表达增加，并促进了糖尿病伤口愈合，这是目前用糖尿病患者血液进行血管再生的临床前研究之一。

3.2 降糖药物对于EPCs的影响 EPCs的功能受损及体外扩增困难限制了EPCs移植在临床应用的可行性，因此，从药理学层面探索修复糖尿病导致的祖细胞功能障碍、促进祖细胞的动员及归巢的药物，对于减少血管内皮功能障碍、延缓和改善糖尿病引起的血管并发症具有重要的临床意义。目前一些试验研究了临床常用的口服降糖药物[如二甲双胍、二肽基肽酶-4(Dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)抑制剂、胰高血糖素样肽受体(Glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1)激动剂及钠-葡萄糖共转运蛋白-2(Sodium-glucose cotransporter-2，SGLT-2)抑制剂等]对糖尿病机体EPCs的影响。

3.2.1 二甲双胍 二甲双胍是糖尿病的一线药物，具有减重、降压、降脂，改善心肌重塑的作用，已证实对心血管具有明确的保护作用。Ahmed等[23]为明确二甲双胍对心脏保护作用的机制，进行了一项MRRIT研究，23例无心血管疾病的1型糖尿病患者使用二甲双胍治疗8周，维持稳定的血糖水平不变，发现二甲双胍通过增加EPCs改善了血管内皮功能障碍，这种心脏保护作用超出了血糖水平控制达标对血管内皮细胞的影响。Asadian等[24]发现，胰岛素与二甲双胍联用促进了 T2DM 患者 EPCs 数量的增殖，SDF-1血清浓度的显著增加代表EPCs的迁徙频率增加，此外，还有血管生长因子如VEGF、Ang1 和 Ang2的血清浓度增加，预示着对糖尿病血管具有潜在保护作用。

3.2.2 SGLT-2抑制剂 SGLT-2抑制剂被证实具有保护心脏、肾脏的作用，可降低心衰患者的住院率。在一项随机对照临床试验中，Hess等[25]通过ALDH酶活性量化内皮祖细胞的表达频率的方法，发现使用恩格列净治疗6个月后，促使循环单核细胞的平衡由促炎M1转向抗炎M2表型，其次增加了CD133+的表达频率，在关于氧化应激方面，恩格列净组减少了NADPH氧化酶的产生，降低了氧化应激水平。此外，一项二甲双胍和/或胰岛素治疗的基础上加用卡格列净或安慰剂为期 16 周的双盲、随机、安慰剂匹配试验显示，卡格列净组的CD34+细胞表达趋化因子C-X-C-基元受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4)及 SDF-1显著增加，表明卡格列净改善了祖细胞的迁移功能；并且CD34+细胞的基因表达分析显示，抗氧化剂如超氧化物歧化酶2、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶增加，同时引起内皮标志物(PECAM1、VEGF-A 和 NOS3)的表达上调，这预示卡格列净改善了血管内皮功能，CD34+细胞可以作为评估内皮功能的有价值的生物标志物之一，为临床提前干预提供有价值的线索[26]。

3.2.3 GLP-1受体激动剂 GLP-1是由肠道L细胞分泌的一种肠促胰素，通过促进VEGF的分泌，刺激EPCs数量增加，从而改善内皮功能障碍，达到保护心血管的作用[27]。De Ciuceis等[28]为比较利拉鲁肽与艾塞那肽对EPCs及毛细血管密度的影响，通过流式细胞仪评估治疗4周后的EPCs数量，发现使用艾塞那肽治疗后EPCs的数量及外周静脉毛细血管密度增加，而利拉鲁肽组没有增加，但此实验的样本量较少，存在一些可能导致结果偏倚的混杂因素，如吸烟、高血压病史等，因此，需要更大规模的临床试验研究来证实艾塞那肽对EPCs的受益。除外GLP-1受体激动剂，exendin-4 是一种GLP-1类似物，在一项关于exendin-4对糖尿病大鼠伤口愈合作用的实验中，使用exendin-4腹腔注射4周后，发现exendin-4促使了糖尿病大鼠的伤口闭合，EPCs的数量明显增加，增加了毛细血管的生成及分化，并且减弱了炎症反应[29]。Yang等[30]进一步研究发现，exendin-4改善了高糖毒性对于EPCs形成能力及迁徙功能的损伤，通过SDF-1β/CXCR7-AMPK/p38-MAPK轴抑制促炎因子IL-6 的生成来逆转高血糖诱导的 EPCs功能障碍。

3.2.4 DPP-4抑制剂 DPP-4酶可降解GLP-1，趋化因子SDF-1，因此，DPP-4抑制剂可以通过增加SDF-1来促进祖细胞的动员。在一项沙格列汀联合二甲双胍的双盲随机安慰剂对照试验中，发现CD34+细胞虽无明显的增加，但通过提高CD34+细胞对SDF-1的迁徙反应使祖细胞的迁徙率增加[31]。同样的阳性结果出现在另一项随机对照实验中，沙格列汀组和二甲双胍组均使EPCs的数量增加，且两组之间无显著差异[32]。Awal等[33]研究利格列汀对糖尿病肾病患者内皮功能的影响，31例使用胰岛素或二甲双胍的患者加入利格列汀治疗，12周后发现使用利格列汀组的CD34+和CD34+、CD184+双阳性细胞的数量显著增加，同时改善了动脉僵硬参数和肾功能。

除了降糖药物对EPCs的影响，EPCs也受益于他汀类药物、抗氧化物质及运动等。血管内皮损伤及修复的失衡导致祖细胞数量减少，VEFG降低导致动脉粥样硬化的发生[34]。他汀类药物被证实具有延缓EPCs衰老、促进祖细胞增殖的作用[35]。将普伐他汀添加到体外培养的内皮集落形成细胞(Endothelial colony forming cells，ECFC)后，发现普伐他汀促进了ECFC增殖，增加了蛋白激酶B和eNOS 磷酸化，这可能是他汀类药物改善内皮功能障碍、治疗动脉粥样硬化的机制之一[36]。非诺贝特是一种过氧化物酶体增殖物激活受体α (Peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα) 激动剂，通过抑制NOD样受体热蛋白结构域3炎症小体 (Nod-like receptor protein 3，NLRP3) 来恢复EPCs功能障碍，加速糖尿病小鼠的伤口愈合[37]。番茄红素(Lycopene ，LYC)是一种天然的抗氧化剂，可以恢复糖尿病大鼠EPCs周期阻滞，使其免受晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products，AGEs)诱导的凋亡及氧化自噬，进一步促进细胞的增殖，保护EPCs数量及功能[38]。一项在胰岛素基础上加用硫辛酸治疗的随机对照试验发现，加用硫辛酸治疗后,机体的抗氧化酶活性显著增加，且与内皮祖细胞数量的明显增加和功能的改善具有相关性[39]。除外药物、抗氧化物质，适当的有氧和阻抗运动可以降低全身炎症反应，改善胰岛素抵抗，从而降低糖尿病、代谢综合征发生心血管疾病的风险[40]。Zhai等[41]发现了有氧联合阻抗运动可改善2型糖尿病小鼠EPCs的增殖功能，主要机制可能是有氧联合阻抗运动诱导了caveolin-1蛋白表达的增加。caveolin-1存在于内皮细胞中，对于SDF-1驱动的EPCs动员发挥了核心作用。一项研究对比了运动对1型糖尿病患者与健康人群造血干细胞(Hematopoietic progenitor cells，HPCs)与祖细胞的影响，发现运动促使1型糖尿病患者机体HPCs、EPCs的增加，趋化因子受体CXCR4、C-X-C-基元受体7(C-X-C motif chemokine receptor 7，CXCR7)表达增加，这有助于修复血管内皮损伤，降低1型糖尿病患者出现血管并发症的风险[42]。

4 总结与展望

综上所述，糖尿病引起机体EPCs数量减少、衰老加速、动员招募及归巢障碍，因此，增加糖尿病患者EPCs数量、保护EPCs免受氧化应激及高糖损伤是逆转糖尿病血管并发症的一个可能的方向。糖尿病患者外周血中EPCs数量少、EPCs分离困难、具有质量难控性，需要大量的临床试验来证实细胞移植的安全性及有效性。目前研究的降糖药物、降脂药物及抗氧化物质对于糖尿病EPCs的影响是有益的，但仍需更多的临床试验样本以及更长的临床观察时间来明确药物对于远期防治糖尿病血管并发症的作用，这对于预防糖尿病导致的微血管病变，动脉粥样硬化，降低糖尿病心血管事件风险具有重要的临床意义。