快速现场评价在诊断性介入肺脏病学中的应用进展

张 黎 综述，周 梅 审校

(重庆市渝北区人民医院呼吸与危重症医学科，重庆 401120)

快速现场评价(ROSE)是一种在穿刺、活检、刷片等方法收集标本时，相关人员在场，对所得标本满意度进行快速评价、得出初步诊断和优先策略，反馈指导下一步操作的技术。ROSE可用于多学科，在诊断性介入肺脏病学操作中，ROSE 是一项实时伴随于取材过程的快速细胞学判读技术。靶部位取材时，在基本不损失组织标本的前提下，将部分取材印涂于玻片，制成细胞学片基，迅速染色并以专用显微镜综合临床信息立即判读。作为一种细胞学载体，ROSE具备相应功能，包括评价取材满意度、实时指导介入操作手段与方式、形成初步诊断或缩窄鉴别诊断范围、优化靶部位标本进一步处理方案、结合全部临床信息与细胞学背景进行病情分析与转归预判[1]。但ROSE的应用是否有益仍存在争议，仍需进一步研究以获取最佳的方法及标准，故本文拟将最新的ROSE在诊断性介入肺脏病学的应用进展展开综述。

1 ROSE的细胞学评判进展及操作者的选择

ROSE是一个简单而复杂的程序，具体的操作可以分为3个步骤:生产、染色、读片解释。由于ROSE的目的是实时指导干预过程，其技术核心有两点:一是尽可能提高膜片的制作和染色速度；二是准确解释细胞学结果。因此，可能影响主要结果的ROSE处理信息包括如涂片方法、涂片技师的水平、染色方法、染色技师的水平、有创程序、读片技师的职业等[2]。

在涂片方法上包括:印片(滚片)、刷片(涂片)、喷片、留片[1]；在染色方法上，可采用迪夫染色、甲苯胺蓝染色、刘氏染色等，均可在1 min内完成染色内容[3]，WHO 推荐采用迪夫染液对 ROSE 细胞学片基进行快速染色[1]。迪夫染色与瑞氏染色类似，经技术改良而成，结果也和瑞氏染色类似。迪夫染色耗时很短，仅30～70 s。因为制片、染色耗时极短，使 ROSE 判读过程几乎与介入操作过程形成“实时”反馈。染色时推荐采用“浸染”而非“滴染”以提高染色质量与效率[4-5]。

如何判断涂片的质量？有学者研究了如何判断ROSE样本是否充足的简单算法，2位病理学家分别对133例患者300个淋巴结行超声内镜引导下经支气管针吸活检(EBUS-TNBA)的ROSE涂片进行回顾，并将其结果与最终病理结果进行比较，发现采用组织核心大小(组织核心大于或等于2 cm)、有无恶性细胞、可见炭疽色素(MAP)和淋巴细胞密度增加(LD)≥40个细胞/苏木精-伊红(HP,40×)，敏感性和准确率分别从64.4%提高至98.6%和64.7%提高至97.3%[6]。有研究通过对不同细胞形态参数的分析，发现对于腺癌，核仁和小/中细胞团簇的结合具有最佳的敏感性和特异性，对于鳞状细胞癌，坏死大于或等于50%和大细胞团簇的结合具有最佳的敏感性和特异性。对于小细胞癌，中度坏死(50%)和单细胞存在的诊断准确率最高；总体精确度在90%～97%。该研究表明，仅使用几个容易识别的细胞形态学参数就可以建立ROSE期间最常见肺癌的组织类型。在ROSE中一个准确的诊断可以帮助内镜医师决定需要取多少肿瘤样本，例如腺癌的生物分子特征需要更多的样本，而鳞状细胞癌一个样本就足够了[7]。对于如何更好地判断ROSE涂片的制作及病理学方法，研究尚不多，有待进一步研究。

通常情况下，细胞学ROSE评估应由专业的病理科医师操作，或现场制片将镜下观察图像通过远程系统将数据传输至病理科医师实时评估[7-8]。但由于条件限制，很多呼吸内镜中心缺乏专门的病理科医师，从而限制了ROSE的发展，是否有替代方案？BONIFAZI等[9]报告，经过3个月的细胞病理学培训后，呼吸科医生和细胞病理学家对ROSE的评估达成了81%的总体一致。来自日本的一项研究提示，ROSE由1名呼吸科医生完成，而该医生在1位细胞技术专家的培训下总共工作了1个月，将ROSE的结果与细胞病理学家最终诊断结果进行比较，结果在所有操作中，ROSE的灵敏度为88.5%，特异性为83.0%，诊断准确率为86.4%，提示经过训练的肺科医生通过ROSE对肺癌的判断非常高，与病理学家的结论无明显差异[10]。NATALI等[11]的研究结果也显示，经过专业训练的呼吸科医生可以可靠地评估支气管镜下ROSE涂片的肿瘤负荷，特别是在评价淋巴结疾病时，这对于那些没有定期提供细胞病理学家的机构尤其有用。另一项研究也显示，医学专家对ROSE的判断与病理学家无显著差异，是一个可接受的选择[12]。另外，与细胞病理学家的最终评估相比，由生物医学科学家进行的ROSE和初步充分性评估及初步诊断都具有高度的准确性[13]。上述研究提示，在ROSE过程中，对呼吸内镜医生或呼吸科医生进行培训后可以到达与病理科医师类似的评估水平，特别是对肿瘤性疾病，对一些良性疾病的判别仍存在困难。但培训的内容、时间等是否有标准化的参考仍缺乏研究。

2 ROSE在气管镜中的应用

2.1ROSE在常规经支气管镜针吸活检(c-TBNA)和EBUS-TBNA中的应用 c-TBNA和EBUS-TBNA是诊断性介入肺脏病学中的常见操作，也是呼吸科中ROSE 应用最广泛的领域。MALLYA等[14]研究表明，以组织病理学检查为“金标准”，EBUS-TNBA联合ROSE诊断的总体敏感性和特异性分别为85.4%和89.6%，单纯恶性肿瘤的敏感性和特异性分别为100.0%和98.4%，从而认为这种新方法安全性高、诊断率高，在辅助介入支气管镜安全、准确诊断方面具有很好的潜力，ROSE促进样本充足，也有助于快速临床决策。另一项236例患者EBUS-TBNA的研究显示，ROSE组的病理分层诊断率明显高于非ROSE组(90.5%vs.81.2%，P=0.003)，当对肺癌患者肺门或纵隔淋巴结进行取样时，可疑结果的发生率较低，因此提高了病理学分层诊断的诊断率[15]。专家和科学协会指南建议使用ROSE和EBUS-TBNA优化肺癌基因分型，但尚未开展比较试验来确认和量化其有效性，TRISOLINI等[16]的研究结果显示，ROSE防止了对至少1/10的晚期肺癌患者进行分子谱分析的重复侵入性诊断程序的需要，并且显著降低了提取样本的风险。不仅仅是肿瘤性疾病，在许多非肿瘤疾病中，ROSE也显示出了积极的作用。关于一项EBUS-TNBA用于肉芽肿性疾病淋巴结取样进一步ROSE的研究表明，ROSE与最终的细胞学诊断有很高的一致性，且ROSE可以缩短手术时间，加强样本筛选，并消除进一步侵入性检查的需要，唯一与一致性增加相关的变量是操作者的经验[17]。另一项对80例疑似结节病的患者的随机对照研究显示，当对疑似结节病进行TBNA时，c-TBNA伴ROSE和EBUS-TBNA(伴ROSE或不伴ROSE)优于单独的c-TBNA，但c-TBNA伴ROSE是否可以等同于EBUS-TBNA，由于样本量不多，这项研究尚无法确定，有待进一步大样本的研究[18]。在没有EBUS的中心，与单一c-TBNA相比，同时与ROSE联合使用的TBNA产生的适宜样本比例增加，可以缩短手术时间，增强样本筛选，从而限制进一步侵入性诊断检查的需要[19]。带ROSE的c-TBNA是一种安全、有效、经济的支气管镜检查方式，当操作员常规执行带ROSE的c-TBNA时，可以获得与EBUS-TBNA相似的诊断产量，即使在有EBUS设施的中心，c-TBNA也应该常规进行[20]。提示ROSE在c-TNBA中的收益可能大于在EBUS-TNBA中的收益。

然而，一篇meta分析荟萃了5项研究后认为虽然在EBUS-TBNA期间，使用ROSE与针吸的次数较少以及在TBNA期间进行额外支气管镜检查以作出最终诊断的总体需求较低相关，在c-TNBA中使用ROSE可以缩短并发症的发生(但在EBUS-TNBA时没有发挥该作用)，但是使用ROSE既不能提高TBNA的诊断率，又不能减少手术时间，该研究认为虽然ROSE是否用于所有TNBA患者还有争议，但可以用于高危患者，比如多重疾病患者以减少气管镜的程序[21]。在另一前瞻性研究中，348例EBUS-TBNA手术中，有213例使用ROSE进行，诊断的准确率从84.4%提高至90.6%，但P=0.082，且在多变量模型中进行调整后，ROSE的益处仍未达到统计学差异显著性。在恶性疾病或结节病的亚组患者中也得到了类似的结果。病变的大小并不影响ROSE对准确性的影响，该项研究表明ROSE与EBUS-TBNA准确性的适度提高相关，但差异无统计学意义(P>0.05)[8]。

ROSE在TNBA中的作用是否重要，仍然存在争议，就现有研究来看，在c-TNNA中的优势大于EUBS-TNBA中的优势，这可能是由于EBUS-TBNA本身已具有较高的诊断率。另外，ROSE的作用与呼吸内镜中心操作者的经验有较大关系，故有待设计更严谨的随机对照试验，更多中心、大样本的试验来消除偏倚，进一步明确ROSE的意义所在。

2.2ROSE在新的肺脏疾病诊断性介入操作中的应用 径向探针支气管内超声(R-EBUS)近年来已成为经支气管活检(TBB)诊断肺周围病变(PPLs)的有力工具，提高了诊断率，影响支气管内超声引导下TBB诊断率的因素通常是探针的位置，病灶的大小、位置，PPLs的CT扫描外观和支气管镜医生的经验。来自台湾的一项研究提示，ROSE可以提高R-EBUS对PPLs的诊断率，特别是对诊断困难的PPLs:病灶直径小于3 cm，支气管征象阴性，位于右肺尖和左肺尖后段，探头靠近处伴有胸腔积液的PPLs。在这项研究中，R-EBUS联合ROSE具有较高的诊断效果，诊断率在53%～94%。ROSE提高了所有相关专家的诊断能力，特别是难以触及的具有挑战性的病例，操作者可以根据ROSE结果改变穿刺部位、穿刺深度或穿刺角度。R-EBUS引导下的TBB没有实时超声引导下的采样，使用R-EBUS引导下TBB钳采集的标本比EBUS-TBNA采集的标本大，且使用ROSE后可降低支气管肺泡灌洗(BAL)的比例，避免额外的诊断程序，降低支气管镜的并发症发生率而不损失诊断率。尽管BAL等额外诊断程序的比例降低了，但ROSE组并不能缩短支气管镜检查时间，因为ROSE的涂片准备和复查需要时间[22]。另一项R-EBUS联合ROSE的研究也提示，ROSE可提高诊断率，缩短手术时间，且未观察到严重的手术相关并发症，如气胸和出血，R-EBUS联合ROSE是诊断肺周围病变是一种安全有效的方法[23]。

目前，气管镜对PPLs的诊断率仍然不足，为了提高气管镜的诊出率，一项纳入了45例患者的研究联合支气管超声(EBUS)、虚拟支气管镜导航(VBN)和ROSE等技术，提示联合使用这些技术可能有助于肺癌的诊断[24]。电磁导航支气管镜(ENB)常常和R-EBUS联合使用，是用于周围型肺部病灶诊断的新兴技术，一项国内最新研究显示，电磁导航支气管镜活检联合 ROSE 更适用于肺外周型孤立性结节的诊断[25]。全肺实时诊疗导航(Lung-Pro)支气管镜技术是通过对患者薄层高分辨率CT数据进行三维重建，再结合虚拟支气管镜技术，深入到达12～14级支气管结节部位，实现肺部病灶的实时导航和精确定位，一项国内的研究表明，Lung-Pro导航可精确抵达病灶取得病理组织，有较高的诊断率，且有导航及手术时间短、安全、并发症少等优点，与ROSE结合可提高取样质量，减少活检、穿刺次数，从而减少并发症发生[26]。

PPLs的诊断一直是临床的挑战，机器人辅助的支气管镜平台已经被开发出来，有可能提高PPLs的诊断率。一项前瞻性、多中心试点的研究，在PPLs 1～5 cm大小的患者中使用了一种机器人支气管镜系统，该系统具有母女配置。主要终点是利用R-EBUS成像成功定位病变和观察手术相关不良事件的发生率，所有病例均采用ROSE，ROSE确诊时仅经支气管针吸即可；当ROSE不能诊断时，使用机器人平台进行经支气管活检，然后由研究者自行决定常规引导的支气管镜入路。54例中有53例有R-EBUS影像。53例患者中51例(96.2%)病灶定位成功。这是首个对PPLs患者进行机器人支气管镜检查的前瞻性、多中心研究。96.2%的病例成功进行了病灶定位，不良事件发生率与传统的支气管镜手术相当[27]。

上述研究提示，对于取材较困难的肺外周性病变，在使用各种介入肺脏病学临床检查取材时联合使用ROSE，可以提高诊断率、减少操作流程，但仍需更多的大样本研究。

3 结合其他方法的ROSE

传统意义上的ROSE是一种细胞学诊断方法，然而，到目前为止，还没有建立在气管镜检查中对TBB标本进行快速现场组织病理学诊断的方法。有研究显示了未来组织病理学现场评价开发的价值，基于探针的共聚焦激光显微内镜(pCLE)是一种新颖的、无创的技术，在支气管镜检查中提供实时肺成像，采用吖叮黄对TBB标本进行染色，利用pCLE对离体标本进行良恶性结构评估，根据细胞密度和核大小差异对良恶性病变进行分类，并确定是否可以通过pCLE对TBB标本进行快速的组织病理学诊断。对36例标本研究后显示对恶性肿瘤的敏感性为91.3%，特异性为76.9%。因此认为pCLE可以作为一种工具在支气管镜检查中用于快速的组织病理学现场诊断[28]。

快速现场诊断对早期肺癌是非常必要的，有学者研究了一种新的诊断照明纳米技术，他们通过EBUS-TBNA、常规气管镜等获取的淋巴结、癌组织和异常肺内病变中提取组织标本，制备了30例患者的30份组织标本，随后将CytoViva®照明纳米技术应用于每个活检组织切片。细胞viva软件一旦为每个实体组织创建了特定的光谱库，就能够在随后的成对的同一疾病的幻灯片中再次识别出同一疾病。对该技术的进一步评价可以使这种照明纳米技术成为一种有效的快速现场诊断工具。DARWI-CHE等[29]目前已经制作了一种探针，可以通过支气管镜的工作通道插入，其能够创建探针接触到的任何组织的光谱库，而不需要进行组织取样和准备检查的载玻片，然而还需大量的临床试验以检测该技术的优缺点。

一项国内的研究探讨应用xTAG70plex液相芯片技术对非小细胞肺癌(NSCLC)患者的ROSE细胞学制片进行EGFR、KRAS和PIK3CA基因检测的可行性及其临床价值，结果显示除1例在组织学标本检出为KRAS突变而在配对的 ROSE细胞学标本没有检测出来的病例外，其他病例基因突变检测结果均相同，2种标本EGFR基因突变检测结果一致率为100%，KRAS基因突变检测结果一致率为98.7%。提示xTAG70plex液相芯片技术可以有效地检测ROSE 细胞学制片EGFR、KRAS和PIK3CA的基因突变状态，对于NSCLC患者，ROSE细胞学制片可以作为组织学替代标本进行基因检测[30]。

上述最新的研究提示ROSE发展的新方向不仅仅是限于细胞学的现场诊断及评估，还应该向现场组织病理学、更具分辨性的光谱分析、基因分析等方向发展。

4 结语与展望

ROSE作为一种以细胞学为背景的快速现场评价，在诊断性介入肺脏病学中已经得到广泛应用，虽然存在争议，但对所得标本满意度进行快速评价、得出初步诊断和优先策略方面的优势是有目共睹的。如何更好地应用ROSE，规范的取材、印染、读片技术都很关键，未来希望有更严谨的研究以帮助制定更详细的指南规范上述操作过程。ROSE应用于c-TBNA的优势较EBUS-TNBA更明显，这可能是由于EBUS-TBNA本身已具有较高的诊断率。对于取材较困难的肺外周性病变，ROSE联合R-EBUS、VBN、ENB、Lung-Pro、机器人辅助的支气管镜平台等新的诊断学介入方法的优势更为明显。另外，ROSE发展的新方向不仅仅是限于细胞学的现场诊断及评估，还应向现场组织病理学、更具分辨性的光谱分析、基因分析等各方向发展，以丰富诊断方法，提高肺部疾病诊断率。ROSE是一项简单有复杂的技术，存在更多可能性，值得开展更多深入及拓展性的研究。