‘华仲12号’杜仲叶片黄酮类物质组成鉴定及含量分析

李 慧，张 婉，李 静，朱景乐，陈梦娇，唐 骏，孟益德，刘 丹

（1.河南农业大学，河南 郑州 450002；2.中国林业科学研究院 a.经济林研究所；b.经济林种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室，河南 郑州 450003；3.中国农业科学院 果树研究所，辽宁 兴城 125100；4.国有信阳市平桥区天目山林场，河南 信阳 464100；5.山东省林草种质资源中心，山东 济南 250102）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.为杜仲科杜仲属单科单属植物，是一种名贵的中药材和重要的经济树种。杜仲多以皮入药，但有关研究结果表明，其叶片与树皮有着相似的化学成分和抗氧化活性，且杜仲叶片的再生能力强，叶片资源更加丰富也更容易采取[1]。黄酮类物质具有抗氧化、抗癌、增强免疫力等多种功效，是杜仲叶中一类重要的活性成分，其在杜仲叶片和树皮中的含量相近，因此，亦可以叶片代替树皮作为药源[2-5]。‘华仲12 号’杜仲Eucommia ulmoides‘Huazhong No.12’是叶片变异型的杜仲品种，其叶片呈现红色，与叶片呈绿色的杜仲相比，‘华仲12 号’杜仲表现出更加优良的园林观赏价值[2]。有关研究结果表明，黄酮类物质在组成和含量上的差异是影响植物叶色表现的重要因素，对于不同品种杜仲来说，其叶色的不同与黄酮类物质的组成和含量都有一定的相关性[6-10]。为了进一步了解‘华仲12 号’杜仲叶片呈现红色的现象与黄酮类物质组成和含量之间的相关性，以叶片呈绿色的‘华仲11 号’为对照，检测并分析‘华仲12 号’与‘华仲11 号’杜仲叶片中黄酮类物质的组成和含量，以期为后期关于‘华仲12 号’杜仲合理定向化利用的研究奠定基础。

近些年来，针对杜仲叶片中生物活性物质的提取方法、药理分析、活性物质与其生态因子间的相关性等方面的研究不断深入[11-14]，但有关‘华仲12 号’杜仲叶片中黄酮类物质的组成成分及含量的分析鲜见报道。常用于检测黄酮类物质的方法有超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法、紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法等，与后两种方法相比，超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法具有自动化程度高、分离速度快、定性准确等优点[15-17]。黄酮类物质是以2-苯基色原酮（图1）为母核的化合物，其组分复杂，本研究运用UPLC-PDA-MS/MS 法，通过将其与标准品比对，采用色谱与质谱信息分析、数据分析等方法，对‘华仲12 号’杜仲叶片中黄酮类物质分别进行定性与定量分析，并选取叶色呈绿色的叶用型良种‘华仲11 号’杜仲Eucommia ulmoides‘Huazhong No.11’叶片作为对照材料，比较分析两种杜仲无性系叶片中黄酮类物质组成与含量的差异情况，以期为 ‘华仲12 号’杜仲合理的定向化利用的研究奠定理论基础。

图1 2-苯基色原酮的化学结构式Fig.1 Chemical structure of 2-phenyl-chromone

1 材料与方法

1.1 材 料

供试的‘华仲12 号’与‘华仲11 号’杜仲叶片均采自于河南省新乡市原阳杜仲良种繁育圃。标准品分别为矢车菊素-3-O 葡萄糖苷、槲皮素-芸香糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、芦丁、山柰酚-葡萄糖苷，均为美国Sigma-Aldrich 公司生产。

1.2 黄酮类物质的提取与纯化

将采集的‘华仲12 号’与‘华仲11 号’杜仲叶片迅速地分别置于液氮中冷冻，并利用冷冻研磨机（SPEX 公司）研磨成粉，分别称取约为1.0 g 的样品，加入10 mL 的甲醇（HPLC 级，美国Fisher公司），以超声波超声提取20 min，然后置于高速冷冻离心机（CF16RXII 式，日本日立公司）中，以10 000 r·min-1的转速离心5 min，分别取上清液（提取液）以备用。参照相关文献[18]中说明的方法分别进行纯化，对其中的部分步骤有所改进，将所用的样品提取液、淋洗所用的甲醇、最终定容体积均改为5.0 mL，淋洗固相萃取小柱的水体积为2.5 mL，纯化后再上机检测。

标准品的制备：每种标准品各准确称取5.0 mg，以甲醇溶解并定容至10 mL，得到500 mg·L-1的标准品储备液，根据需要配置成适宜浓度的标准溶液使用液。

1.3 UPLC 和MS/MS 条件

UPLC 条件：柱温40 ℃，进样量2.0 μL，流速0.3 mL·min-1。流动相A、B 分别为乙腈（HPLC 级，美国Fisher 公司生产）和0.5%的甲酸（LCMS 级，美国Anaqura Chemicals Supply 公司生产）。A 液的洗脱梯度为：0%，0 min；10%，1 min；20%，10 min；25%，16 min；80%，18 min；洗脱20 min后回到初始状态，平衡5 min。

MS/MS 条件：参考有关文献[19]进行设定。

1.4 杜仲叶片中黄酮类物质组成的鉴定与含量的测定

因为不能确认两种杜仲叶片中所含有的黄酮类物质的具体组成，无法获取全部相应物质标准品，对于有标准品的物质，可以利用标准品的保留时间和MS/MS 质谱信息，结合其相对分子质量及二级质谱碎片离子进行结构分析，完成对该黄酮类物质的定性分析；而对于未获得相应标准品的物质，则可结合其苷元及糖基等信息进行鉴定。

采用相对定量的分析方法，采用正离子MRM模式，将标准品配制成不同浓度的标准溶液使用液，用外标法准确测定杜仲叶片提取液中相应物质的含量，根据标准品的峰面积及含量、从提取液中测得的其他黄酮类物质的峰面积，运用公式（1）计算出各黄酮类物质的含量。因为无法得到全部相应黄酮类物质的标准品，无法准确确定黄酮类物质的质谱响应差异，所以先假设各种黄酮类物质的质谱响应与标准品一致，即Fj=1，Fj表示相同摩尔质量的化合物j与标准品i在相同试验条件下检测信号的比值，然后按式（1）计算各黄酮类组分的含量。所有的测定结果均以3 次测定值的（平均值±标准差）来表示。

式（1）中：j表示利用标准品测定其含量的某种黄酮类物质，Cj表示其含量；i为标准品；A为某种黄酮类物质的峰面积；M为某种黄酮类物质的相对分子质量。

1.5 数据处理

使 用Microsoft Excel 2016 和SPSS 25.0 软 件进行数据处理和作图。

2 结果与分析

2.1 ‘华仲12 号’杜仲叶片中黄酮类物质的组成

‘华仲12 号’杜仲叶片中15 种黄酮类物质的色谱图如图2所示，各类黄酮类物质的化学结构式如图3所示，图2和图3中的数字均表示峰号；15 种黄酮类物质的保留时间、分子离子的质荷比（m∶z）、碎片离子质荷比及物质组成与含量见表1，表1中的峰号分别与2 和图3中的数字相对应。

表1 ‘华仲12 号’杜仲和‘华仲11 号’杜仲叶片中黄酮类物质组成及含量（n=3）Table 1 Composition and content of flavonoids in leaves of E.ulmoides ‘Huazhong No.12’ and ‘Huazhong 11’ (n=3)

图2 ‘华仲12 号’杜仲叶片中15 种黄酮类物质的色谱图Fig.2 Chromatogram of 15 flavonoids in leaves of E.ulmoides ‘Huazhong No.12’

图3 ‘华仲12 号’杜仲叶片中各类黄酮类物质的化学结构式Fig.3 Chemical structure of flavonoids in leaves of E.ulmoides ‘Huazhong No.12’

由表1可知，‘华仲12 号’杜仲叶片中共检测出15 种黄酮类物质，根据其苷元结构可将15 种黄酮类物质划分为3 类：槲皮素糖苷类有10 种，分别为槲皮素-脱氧己糖-己糖-己糖、槲皮素-戊糖酰-己糖酰-己糖、槲皮素-己糖-己糖、槲皮素-戊糖酰-芸香糖苷、槲皮素-戊糖-己糖、槲皮素-脱氧己糖-己糖、槲皮素-芸香糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-丙二酰-葡萄糖苷；山柰酚糖苷类有3 种，分别为山柰酚-芸香糖苷、山柰酚-葡萄糖苷、山柰酚-丙二酰-葡萄糖苷；矢车菊素糖苷类有2 种，分别为矢车菊素-3-桑布糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。在相同的试验条件下，‘华仲11 号’杜仲叶片中共检测出12 种黄酮类物质，包括槲皮素糖苷类的9 种和山柰酚糖苷类的3 种。比较分析可知，槲皮素-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O 桑布糖苷、矢车菊素-3-O 葡萄糖苷此3 种物质都是‘华中12 号’杜仲叶片独有的。

图2A 显示，在相同的试验条件下，峰号分别为7、8、9 和11 的保留时间和二级质谱碎片离子的质荷比（m∶z）与其对应标准品的均相似，据此可识别出其对应的黄酮类化合物可能分别为芦丁、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和山柰酚-芸香糖苷。

由图2A 可知，峰号1、2、3 对应的化合物分子离子的质荷比分别为773、759、627，据此可以初步判断，峰号1、2、3 对应的物质可能分别为槲皮素-脱氧己糖-己糖-己糖、槲皮素-戊糖酰-己糖酰-己糖、槲皮素-己糖-己糖，测得的其相对分子质量与其对应的理论相对分子质量都相匹配。对照图3中黄酮类物质的化学结构式分析可知，峰号1 对应的特征子离子碎片的质荷比分别为627、465、303，其代表的物质可能分别为槲皮素-脱氧己糖-己糖-己糖失去一分子脱氧己糖（其质荷比为627）、槲皮素-脱氧己糖-己糖-己糖失去一分子脱氧己糖和一分子己糖（其质荷比为465）、槲皮素-脱氧己糖-己糖-己糖失去一分子脱氧己糖和两分子己糖（其质荷比均为303）的碎片离子；峰号1 对应的碎片离子的质荷比为611，其可能是槲皮素-脱氧己糖-己糖-己糖失去一分子己糖的碎片离子。峰号2 对应的特征子离子碎片的质荷比分别为627、465、303，其可能分别为槲皮素-戊糖酰-己糖酰-己糖失去一分子戊糖（其质荷比为627）、一分子戊糖和一分子己糖（其质荷比均为465）、一分子戊糖和两分子己糖（其质荷比均为303）的碎片离子；峰号3 对应的特征子离子碎片的质荷比分别为465、303，其可能分别为槲皮素-己糖-己糖失去一分子己糖、失去两分子己糖的碎片离子。

峰号4 对应的分子离子的质荷比为 743，初步判断其代表的物质为槲皮素-戊糖酰-芸香糖苷，其特征碎片离子的质荷比分别为611、465、303，其可能分别为槲皮素-戊糖酰-芸香糖苷失去一分子戊糖（其质荷比为611）、失去一分子戊糖和一分子鼠李糖（其质荷比均为465）、失去一分子戊糖和芸香糖（葡萄糖+鼠李糖）（其质荷比均为303）的碎片离子。峰号5 和6 对应的分子离子的质荷比分别为 597 与611，可初步判断其代表的物质分别为槲皮素-戊糖-己糖和槲皮素-脱氧己糖-己糖；峰号5 对应的特征碎片离子的质荷比分别为465 与303，其代表的物质可能为槲皮素-戊糖-己糖失去戊糖和失去戊糖及己糖的碎片离子；峰号6 对应的特征碎片离子的质荷比分别为465与303，其代表的物质可能分别为槲皮素-脱氧己糖-己糖失去一分子脱氧己糖和失去脱氧己糖和己糖的碎片离子。

峰号10 和13 对应的分子离子的质荷比分别为551 与535，初步判断其代表的物质分别为槲皮素-丙二酰葡萄糖苷和山柰酚-丙二酰葡萄糖苷，且测定的相对分子质量与其对应的理论相对分子质量相匹配。其碎片离子的质荷比分别为303 与287，其可能分别是槲皮素-丙二酰葡萄糖苷和山柰酚-丙二酰-葡萄糖苷失去丙二酰葡萄糖的碎片离子。

峰号12 对应的分子离子的质荷比为443，初步判断其代表的物质为山柰酚-葡萄糖苷，测定的相对分子质量与其对应的理论相对分子质量一致；其碎片离子质荷比为287，其可能是山柰酚-葡萄糖苷失去一分子葡萄糖的碎片离子。

对于‘华仲12 号’杜仲叶片中矢车菊素糖苷类物质的检测结果，可以通过将其与标准品进行比对而确认。根据图2B 中杜仲叶片提取液在510 nm 波长下的谱图中的保留时间，可初步判断‘华仲12 号’杜仲叶片中含有矢车菊素-3-O 桑布糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。由表1可知，峰号14 和15 分别代表矢车菊素-3-O-桑布糖苷与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，其碎片离子的质荷比分别为287 与287，推测其分别为矢车菊素-3-O 桑布糖苷失去一分子桑布糖和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷失去葡萄糖的碎片离子（图3C）。这一结果表明，在相同的试验条件下，杜仲叶片中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的色谱保留时间、二级质谱碎片离子与其对应的标准品均一致；杜仲叶片中矢车菊素-3-O-桑布糖苷的色谱保留时间、二级质谱碎片离子与其对应的质谱分析参数也都一致。根据上述分析结果可以鉴别，‘华仲12 号’杜仲叶片中很可能含有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-桑布糖苷。

图4 华仲12 号’杜仲和‘华仲11 号’杜仲叶中15 种黄酮类物质的含量分布情况Fig.4 Content distribution of 15 flavonoids in leaves of E.ulmoides ‘Huazhong No.12’ and ‘Huazhong 11’

2.2 杜仲叶中黄酮类物质的含量及分析

两种杜仲叶片中各种黄酮类物质的含量见表1。由表1可知，‘华仲11 号’杜仲叶片中12 种黄酮类化合物的总含量为4.136 6 g·kg-1，‘华仲11 号’杜仲叶片中槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-丙二酰-葡萄糖苷、槲皮素-戊糖-己糖、槲皮素-芸香糖苷的含量均相对较高，其含量与‘华仲11 号’杜仲叶片中其他黄酮类物质的含量均有显著差异。

从表1中还可看出，‘华仲12 号’杜仲叶片中共检测到15 种黄酮类物质，其总含量为36.732 3 g·kg-1，约为‘华仲11 号’杜仲叶片中黄酮类物质总含量的8.88 倍。其中，槲皮素糖苷类（10 种）、山柰酚糖苷类（3 种）、花色苷类（2 种）物质的含量分别占其黄酮类物质总含量的94.33%、4.39%、1.29%。槲皮素-戊糖-己糖和槲皮素-3-O-葡萄糖苷都是‘华仲12 号’杜仲叶片中的主要黄酮类物质，其含量分别占其组分总含量的48.80%与27.67%，此二者与‘华仲11 号’杜仲叶片中对应组分含量的差异均显著，且与‘华仲11 号’杜仲叶片中其他黄酮类组分的含量相比亦有显著差异。作为‘华仲12 号’杜仲叶片中独有的物质，槲皮素-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-桑布糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量分别为0.494 9、0.440 0、0.035 1 g·kg-1。比较分析‘华仲12 号’与‘华仲11 号’杜仲叶片中黄酮类物质的组分与含量可知，除了‘华仲12 号’独有的3 种物质及槲皮素-脱氧己糖-己糖-己糖、槲皮素-丙二酰-葡萄糖苷、山柰酚-芸香糖苷、山柰酚-丙二酰-葡萄糖苷外，‘华仲12 号’与‘华仲11 号’杜仲叶片间对应的其他黄酮类物质的含量均表现出显著差异。

3 讨论与结论

在反相液相色谱分离过程中，含有葡萄糖的黄酮醇糖苷类化合物的色谱保留时间一般长于含有半乳糖的[20]。槲皮素-3-O-葡萄糖苷与槲皮素-3-O-半乳糖苷均属于异构体，结合保留时间及二级质谱碎片离子分析后判断，峰号8 和9 所代表的物质分别为槲皮素-3-O-半乳糖苷与槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

不同品种的杜仲叶片中黄酮类物质的组成有所不同。研究结果表明，‘华仲12 号’杜仲叶片中独有的3 种黄酮类组分分别为槲皮素-半乳糖苷、矢车菊素-桑布糖苷和矢车菊素-葡萄糖苷。唐芳瑞等[21]从杜仲叶片中鉴定出的8 种黄酮类物质中，除了quercetin-3-O-rutinoside、quercetin-3-O-glucoside、quercetin-3-O-galactoside之外，还包括本研究未测得的槲皮素、quercetin-3-O-sambubioside、kaempherol-3-O-sambubioside 等。闫建昆等[22]从杜仲的干燥叶中分离得到了圣草素、山柰酚-3-Oα-L-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-β-D-6’-乙酰基吡喃葡糖苷等8 种黄酮类物质。在上述已报道的杜仲叶片中的黄酮类物质中，‘华仲12 号’杜仲叶片中含有的矢车菊素-桑布糖苷和矢车菊素-葡萄糖苷均未见报道。

本研究从‘华仲12 号’杜仲叶片中鉴定出的黄酮类物质共有15 种，与从‘华仲11 号’杜仲叶片中鉴定出的黄酮类物质相比，槲皮素-半乳糖苷、矢车菊素-桑布糖苷、矢车菊素-葡萄糖苷均为‘华仲12 号’杜仲叶片中独有的，其含量分别占其组分总含量的1.39%、1.12%、0.10%。‘华仲12 号’杜仲叶片中黄酮类物质的总含量高达36.732 3 g·kg-1，约为‘华仲11 号’杜仲叶中的8.88 倍，说明‘华仲12 号’杜仲叶片中黄酮类物质的含量远高于‘华仲11 号’的。且作为‘华仲12 号’杜仲叶片中黄酮类物质的主要组分，槲皮素-戊糖-己糖和槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量分别高达17.924 0 与10.164 1 g·kg-1，无论是与供试材料中其他黄酮类物质相比，还是与‘华仲11 号’杜仲叶中各对应组分相比，这2 种组分都有显著差异。路买林等[23]曾报道，花色苷含量的变化是‘华仲12 号’杜仲叶色呈现红色的直接原因。朱景乐等[24]曾以杜仲的3 种优良无性系‘华仲11 号’‘华仲12 号’和密叶杜仲为试验材料，采用分光光度计法测定其叶片中花色苷的含量，结果表明，‘华仲12 号’杜仲叶片中花色苷的含量显著高于‘华仲11 号’杜仲叶片的，是‘华仲11 号’杜仲叶片的1.8 倍，他们指出，叶片中高含量的花色苷是‘华仲12 号’杜仲叶片表现出红色的主要原因。本研究结果表明，‘华仲12 号’杜仲叶片具有3 种独有的物质，其中的矢车菊素-桑布糖苷和矢车菊素-葡萄糖苷均属于花色苷类，据此推测，‘华仲12 号’杜仲叶片的呈色很可能与其独有的物质有重要关系。再者，黄酮类物质具有良好的药用价值，‘华仲12 号’杜仲叶片中高含量的黄酮类物质使其具有良好的开发利用前景。

综上所述，本研究从‘华仲12 号’杜仲叶片中共鉴定出15 种黄酮类物质，包括槲皮素糖苷类（10 种）、山柰素糖苷类（3 种）及花色苷类（2 种）物质。‘华仲12 号’杜仲叶片中存在高含量的黄酮类物质，与‘华仲11 号’杜仲相比，其多种组分含量也均显著较高，且其独具槲皮素-半乳糖苷、矢车菊素-桑布糖苷和矢车菊素-葡萄糖苷这3 种物质。此3 种其独有的物质及多种高含量黄酮类组分的存在，可能共同影响着‘华仲12号’杜仲叶片的呈色，也是影响杜仲品种的观赏价值、药用价值及开发利用前景的重要因素。此研究结果对于 ‘华仲12 号’杜仲叶片化学成分的研究、特定组分的高效积累机理的研究、‘华仲12 号’杜仲的定向利用研究等方面都具有重要意义。