乙酰氨基阿维菌素合成工艺探究

陈东

（宁夏泰益欣生物科技有限公司，宁夏银川 750205）

乙酰氨基阿维菌素是以阿维菌素为原料药进行合成的一种高效、广谱、低残留的兽用驱虫药物，此种药品是美国食品药品监督管理局（FDA）和欧盟批准的唯一应用于泌乳奶牛不需弃奶的广谱驱虫药，由默克公司于1997年开发，是第1个可以应用于奶牛和肉牛，而不需要休药期的广谱抗寄生虫药，其制剂已在多个国家批准上市[1]。

乙酰氨基阿维菌素是一种16元的大环内酯类抗生素，其基本结构是碳16位上的大酯环和3个主要取代基团，即C-2到C-8位上的六氢苯丙呋喃类，C-13位上的双糖基，C-17到C-18位上的螺酮缩醇基团。乙酰氨基阿维菌素由2种主要成分组成，B1a和B1b（B1a＞90%，B1b＜10%）[2]，如图1所示。

药代动力学研究结果表明，乙酰氨基阿维菌素可以经多种途径吸收，如口服、皮肤接触、皮下或肌肉注射，药效均较好，可迅速分布到全身。但迄今为止，乙酰氨基阿维菌素商品化的制剂只有浇泼剂和注射剂两种[3]。其中，浇泼剂应用于烈性动物比较方便，而注射剂虽然生物利用率较高，但注射部位疼痛明显，对动物的惊扰较大。研究发现，对吸血或吸食体液的线虫和节肢动物的预防效果而言，口服的吸收效果优于透皮吸收。同时，与注射相比，口服给药可以缩短药剂代谢后在粪便中的半衰期，并降低药剂浓度而减轻对环境的毒性[4]，而且口服药剂投药简单、剂量易掌握、准确率高，较适合单胃动物使用。乙酰氨基阿维菌素目前已广泛运用于畜类寄生虫的防治，作为最新一代的兽用驱虫药物，主要用于放置畜类（特别是产乳期）的寄生虫、虱、螨、蝇等各种内外寄生虫，由于其对家畜体内外各种寄生虫的极高活性，以及在乳品中极低的分配系数，使其成为第一个可用于各种家畜任何生长期的杀虫剂，应用于奶牛和肉牛时无需休药期。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

YP4002电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；waters 2487型HPLC（江苏塞恩斯科技有限公司）；HK-3C型酸度计厂家为北京海富达科技有限公司，HS-DHG电热恒温鼓风干燥箱（上海和晟仪器科技有限公司）；pH计；温度计。

1.2 试剂

七甲基二硅氮烷，三氟乙酸锌，硼氢化钠，醋酸铵，碳酸钠，碳酸氢钠，纯化水。

2 材料与方法

2.1 材料来源

本试验所用阿维菌素由宁夏泰益欣生物科技有限公司提供。

2.2 方法

收率=目的产物（实际）生成量/目的产物的理论生成量＊100%或生成目产物的原料量/原料进料量＊100%。

采用单因素分析方法探究各因素对乙酰氨基阿维菌素收率及含量的影响，并建立了HPLC法测定乙酰氨基阿维菌素的含量。色谱条件:WondaSil C18-WR色谱柱(4.6 mm×250mm, 5μm)；流动相为水-乙腈-磷酸二丁胺缓冲液-四氢呋喃(805∶115∶25∶55) ;流速1.0 mL/min，波长为280nm。

3 结果与分析

3.1 氨化反应投料比例的优化

氨化反应过程中投入阿维菌素保护液，再投入七甲基二硅氮烷和三氟乙酸锌，对阿维菌素保护液进行氨化。在此过程中，七甲基二硅氮烷和三氟乙酸锌的投料量对氨化结果具有重要的影响，若投料过多，会导致产品的收率和含量下降，同时也会造成原料的浪费；若投料量过少，则会导致氨化不完全，也会造成乙酰氨基阿维菌素收率和含量的降低。采用下表的比例进行投料，计算乙酰氨基阿维菌素收率和含量。具体实验结果见表1和图2：

表1 氨化反应投料比例对收率和含量的影响

由表1和图2可知，七甲基二硅氮烷与阿维菌素保护液具有一个适当的投料比例，随着七甲基二硅氮烷与阿维菌素保护液的投料比例增大，乙酰氨基阿维菌素的含量和收率均随着比例的增加呈先上升后下降的趋势，结果显示：七甲基二硅氮烷与阿维菌素保护液的最适比例为5:1，此种比例下乙酰氨基阿维菌素的含量和收率均较高。

3.2 氨化反应温度的优化

采用七甲基二硅氮烷与阿维菌素保护液比例为5:1的条件下，研究不同温度条件对乙酰氨基阿维菌素的收率和含量的影响，反应温度设置5个梯度，分别为50、55、60、65和70℃。反应时间控制在200min。具体结果见表2和图3：

由表2和图3可知，共设5个温度梯度，随着温度的上升，乙酰氨基阿维菌素的含量和收率为呈现出规律性的变化，其中含量和收率均在反应温度达到60℃时达到了最大值，分别达到了66.9%和91.8%。整体来看，随着温度的变化，收率呈现相对较为平稳的趋势，表明反应温度对乙酰氨基阿维菌素的收率影响较小，而乙酰氨基阿维菌素的含量随着反应温度的变化波动较大，温度的精细化控制有利于提升乙酰氨基阿维菌素的含量。

表2 氨化反应温度对乙酰氨基阿维菌素收率和含量的影响

3.3 还原剂种类的优化

取阿维菌素氨化液进行还原，还原剂分别以硼氢化钠、醋酸铵、碳酸氢钠和碳酸钠等进行实验，还原性试剂一般采用弱酸强碱盐，但氨化液的还原效果取决于还原剂的种类。在阿维菌素氨化液还原过程中加入一种或几种溶液的混合，有助于促进阿维菌素氨化液的还原，提高产品收率和含量，其结果根据还原液的澄清度进行确定最适还原剂。具体结果见表3：

表3 还原剂种类的优化

实验结果表明，以上4种还原剂均可用于阿维菌素氨化液的还原，但对阿维菌素氨化液的还原程度有一定的影响，由上表中可以看出，4种还原剂对还原程度的影响表现在溶液的澄清度影响如下，溶液澄清度顺序为硼氢化钠＞醋酸铵＞碳酸氢钠＞碳酸钠。在阿维菌素氨化液还原过程中，溶液越澄清表明还原反应进行的越彻底，获得的乙酰氨基阿维菌素的收率和含量越高。

3.4 脱保护反应pH的优化

脱保护反应所用阿维菌素还原液，加入催化剂和无水乙醇后，会对还原液的pH产生较大的影响，因此采用乙酸溶液和5mol/L的氢氧化钠溶液进行调节还原液脱保护后的脱保护液的终止反应pH，此部分确定脱保护反应进行的最适pH，使得脱保护反应达到最大程度。具体实验数据见表4和图4：

表4 脱保护反应pH对乙酰氨基阿维菌素收率和含量的影响

由表4和图4结果可知，脱保护反应溶液的pH对乙酰氨基阿维菌素的含量和收率具有一定的影响，结果显示随着pH的上升，乙酰氨基阿维菌素的含量和收率呈现出先上升后下降的趋势，当溶液的pH为6.0时，乙酰氨基阿维菌素的收率和含量均偏高，分别为92.0%和68.1%。

3.5 正交试验

在优选出来各单因素最佳结果的基础上，确定每个因素的考察范围，采用正交试验法选出最优组合。以氨化反应投料比例（因素A）、氨化反应温度(因素B)、还原剂种类(因素C)、脱保护反应pH(因素D)为考察因素，每因素取3水平，选用L9(34)正交表进行试验，考察各因素对结晶收率的影响，优选最佳结晶工艺。因素水平表见表5，实验结果见表6：

表5 乙酰氨基阿维菌素合成工艺的因素表

表6 乙酰氨基阿维菌素合成工艺条件的正交试验结果

极差分析结果表明，A、B、C、D 4个因素对乙酰氨基阿维菌素收率的影响程度顺序为氨化反应投料比例＞还原剂种类＞氨化反应温度＞脱保护反应pH，各因素最佳组合为A3B1C3D2，即氨化反应投料比例为5.0:1；还原剂种类为硼氢化钠；氨化反应的温度为70℃；脱保护反应的pH为6.0。

3.6 工艺稳定性验证

按照最佳工艺进行了5次平行试验，试验结果见表7。

表7 工艺稳定性验证结果

由实验结果可知，5次平行试验得到的乙酰氨基阿维菌素平均收率在91.46%以上，含量提高至67.1%。且平行试验的相对标准偏差分别为0.08%和0.089%，表明该工艺合理可行。

4 结论

本研究为了提升乙酰氨基阿维菌素的收率和含量，在现有工艺条件的基础上进行调节，分别考察了氨化反应投料比例、还原剂种类、氨化反应温度及脱保护反应的pH等条件对乙酰氨基阿维菌素收率和含量的影响，其结果显示氨化反应投料比例为5:1；氨化反应的温度为70℃；还原剂种类为硼氢化钠；脱保护反应的pH为6.0为最优工艺组合，最终经过5次平行实验验证此最优工艺的稳定性，生产所得的乙酰氨基阿维菌素收率和含量均较为稳定，相对标准偏差均在正常范围内，详细参数可根据实际生产情况进一步优化。