磁性介孔硅用于近红外光介导的肿瘤光热/化疗协同治疗＊

赵福阳 刘冬雪 吴 越

（牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011）

前言

癌症已经成为了人类健康和生活的最大的威胁之一。目前，手术、化疗和放疗是治疗这些恶性肿瘤的三大主要方法，其中化疗被视为最常用的方法。然而，由于化疗所用药物不具备靶向识别能力，所以在杀伤癌细胞的同时也不可避免的损害正常组织和细胞，不仅严重的降低了癌症治疗效果，而且将导致人体免疫功能受损，严重影响机体康复。随着纳米科技的发展，越来越多的科研工作者致力于纳米级药物运输体系的研发，进而改善药效，降低对于正常组织的副作用。到目前为止，多钟多样的纳米级药物运输体系已被研发出来，其中介孔二氧化硅纳米粒子（MSN）由于具有良好的生物降解能力、物理化学稳定性、可调的孔尺寸、大的比表面积和孔体积、容易功能化等优点成为最具潜力的纳米载体。由于功能化的的介孔硅纳米材料可以引入更多的控释因素，很多人开始了基于介孔硅材料的靶向药物控释研究来改善局部目标区域的疗效。根据控制机制，可以将其分为外部刺激和内部刺激。最近，已经证明将内部刺激和外部刺激结合起来能够获得更精准的控释性能。

最近发现，sp2杂化的碳纳米材料，尤其是石墨締纳米片，具有优良的光、电、热性能，广泛用在药物输送、光热治疗及生物传感器等方面。不仅如此，将不同的生物功能分子或无机纳米粒连接于石墨帰表面，可赋予石墨稀纳米材料新的性质和功能,如祀向巧别功能或诊断功能,这也为多功能石墨稀基纳米药物的应用奠定了基础。然而，为了推进石墨蹄基纳米药物的进一步发展，使其具有更强大的功能,还需要做更多的努力工作。例如，（1）如何将高鞭向识别、诊断、化疗、热疗有机结合,实现协同效果；（2）如何降低石墨帰的疏水性和毒性而同时又能维持其载药（化疗）和光热转换（光热治疗）效果；（3）如何改进石墨贿载药方式（弱的相互作用）导致的不稳定的药物负载和释放；（4）如何増强石墨贿表面键合不同功能分子的能力（石墨烯表面的相对惰性使其共价键合功能分子困难）等。

基于石墨烯的光热能力和磁性纳米粒子靶向能力和介孔二氧化硅的药物装载能力，本文设计了以磁性石墨烯纳米片为基底，MSN为壳的纳米药物载体。通过静电吸附作用核载化疗药物奥沙利铂（OP）。通过808 nm激光辐照，磁性石墨烯纳米片吸收近红外光（NIR），将其转化为热，即可实现肿瘤细胞的直接杀伤（光热治疗），又可加速介孔内化疗药物的释放，提高化疗效果，从而实现光热/化疗的协同作用。

一、实验部分

1.试剂与仪器

FeCl3·6H2O、乙酸钠、正硅酸四乙酯和十六烷基三甲溴化铵（CTAB）购买于上海阿拉丁试剂有限公司；胎牛血清（FBS）采买于浙江天杭生物科技股份有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS）和高糖培养液（DMEM）培养基购买于碧云天生物技术有限公司。实验试剂配制用水为去离子水。

通过扫描电子显微镜（SEM，FEG-250，FEI，美国）对样品形貌进行表征；使用紫外-可见分光光度计（UV-Vis，Cary 5000，Agilent，美国）对药物释放进行监测。

2.实验过程

2.1 磁性石墨烯纳米片的制备

通过探头超声1 h，大尺寸氧化石墨烯分散液破碎小尺寸氧化石墨烯纳米片（GO）。将20 mg GO、200 mL乙二醇和 4 ml二甘醇混合后，超声分散，之后依次加入300 mg聚丙烯酸钠、300 mg 乙酸钠和110 mg FeCl3·6H2O。磁力搅拌后，将混合液放置于高压反应釜，200 ℃保持 12 h。反应结束后，乙醇清洗，得到磁性石墨烯纳米片（Fe3O4@rGO）。

2.2 介孔硅包覆磁性石墨烯纳米片的制备

离心将反应物分散于由600 mg CTAB和300 mL 1 mM NaOH组成的混合溶液中。超声混合后，加入3 mL TEOS/APTES/乙醇溶液（体积比6：1：24）中，60 ℃温度下，搅拌24 h。磁力分离后，使用乙醇回流，去除CTAB，得到介孔硅包覆磁性石墨烯纳米片（Fe3O4@rGO@MSN）。

2.3 光热性能测试

将配制好的不同浓度的纳米材料分散液进行探头超声分散，置于石英比色皿中，置于808 nm激光（功率密度1 W/cm2）照射下，使用红外成像仪对分散液的温度变化进行监测，时间为10 min。

2.4 药物装载

避光条件下，将Fe3O4@rGO@MSN纳米片（5 mg）与OP溶液（5 mL，1 mg mL-1）混合，搅拌24 h。离心后，使用PBS清洗数次，将OP/Fe3O4@rGO@MSN纳米片重新分散于在PBS中。通过上清液中OP浓度，计算载药率。

2.5 近红外光响应性药物释放测试

将纳米分散液置于不同pH（和7.4）的PBS缓冲液，而后置于透析管（分子量截留为20 kDa）中，再将透析管沉于对应的PBS缓冲液中，与不同时间点吸取定量透析液，并向母液内补充等量缓冲液。通过UV-Vis分光光度计检测上清液中DOX的释放情况。接下来，使用相同操作测试808 nm激光照射（1 W/cm2，10 min）下DOX释放情况。

2.6 体外细胞毒性及治疗评价

大鼠神经胶质瘤A549细胞在96孔板中培养24 h后，将DMEM培养基替换为含有不同浓度Fe3O4@rGO@MSN纳米片的新鲜细胞培养基。将MTT溶液（20 μL，PBS缓冲液中的 5 mg/mL）加入到每个孔中，再孵育4 h。除去含MTT的细胞培养基后，每孔加入DMSO（150 μL）。然后通过酶标仪测量490 nm处的吸光度。接下来，将上述纳米分散液与A549细胞共孵育4 h后，将A549细胞分为5组：（1）Control；（2）NIR；（3）Fe3O4@rGO@MSN；（4）OP/Fe3O4@rGO@MSN；（5）OP/Fe3O4@rGO@MSN+NIR。其中Ⅱ和Ⅴ组NIR（1 W/cm2，10 min）照射后，继续孵育20 h，使用MTT方法测试细胞存活率。

二、结果与讨论

1.形貌表征

扫描电镜结果显示所制备的磁性石墨稀基介孔桂纳米片的尺寸大约为150 nm，比微米级氧化石墨烯原料的尺寸要小，这是由于在合成过程中连续的强超声及溶剂热处理使氧化石墨烯片破碎的缘故。透射电镜结果显示磁性石墨烯纳米片上均匀地分布着许多小的球形颗粒，它们连同石墨烯纳米片一起被有序的介孔覆盖。通过使用高分辨的TEM可证实球形颗粒是Fe3O4纳米粒子尺寸约为13 nm。

2.光热性能测试

为实现肿瘤的光热治疗，配制了不同浓度的Fe3O4@mSiO2分散液，使用具有组织穿透能力强的808 nm近红外光，作为光源，用以测试光热升温效果。如图1所示，808 nm（1 W/cm2，10 min）激光照射后，不同浓度Fe3O4@mSiO2分散液（50、100、200 μg/mL）的温度分别升高到40.5、46.7、50.6 ℃，其温度与浓度呈正相关，有利于DOX的释放，并作用于肿瘤细胞。而作为对照的PBS，温度仅升高4.3 ℃。

3.NIR控制药物释放测试

OP作为常用的化疗药物，对多种常见恶性肿瘤具有良好的治疗效果。基于此，使用磁性纳米粒子对药物负载与控释性能等方面进行了研究，即以OP为模型药物，设计研究该磁性纳米材料对OP装载与控制释放能力。经UV-Vis光谱测试，磁性石墨烯基介孔硅纳米片对OP的装载率约为22.4%。

药物的定点释放，不仅减少药物的毒副作用，同时能够提升化疗效果。首先，使用pH 7.4为模拟正常人体生理环境，研究了磁性纳米粒子中OP外释放性能。经24 h体外模拟释放，在pH7.4的PBS介质中，OP释放率仅为10.2%，说明OP的释放较低，对正常组织的伤害较低。随后，测试了中性条件下808 nm激光照射条件下的OP释放情况。802 nm激光（1 W/cm2）照射10 min后OP/Fe3O4@rGO@MSN纳米粒子中OP的累积释放率增加到42.5%分析认为由于介质材料的光热效应加速了药物的释放。以上数据表明，以此磁性纳米粒子为载体可有效装载抗肿瘤药物OP，药物释放行为NIR依赖性。

4.体外细胞抗肿瘤实验

生物安全性是纳米材料在生物医药领域能否应用的重要的评价指标之一，因此我们通过MTT实验，对Fe3O4@rGO@MSN纳米片在A549细胞中的生物安全性进行检测。通过将Fe3O4@rGO@MSN 2纳米分散液与A549细胞在不同的时间共同孵育后，A549细胞无中毒现象，即使将纳米分散液的浓度达到400 µg/mL，材料与细胞共培养24 h后，细胞活性仍保持在89%以上（图2），说明该磁性纳米材料具有一定的生物相容性，可以基本满足生物医用的要求。接下来，我们通过相同的MTT法测试了体外抗癌情况。与对照组相比，单一NIR照射没有显著抑制A549细胞生长，即NIR对A549细胞没有明显杀伤作用。其它各实验组均表现出浓度依赖性细胞毒性。OP/Fe3O4@rGO@MSN（200 μg/mL）与A549细胞共孵育后，细胞存活率为72.1%。当采用808 nm激光照射Fe3O4@rGO@MSN和OP/Fe3O4@rGO@MSN孵育的A549细胞时，细胞存活率分别下降到35.7%和6.5%，分析认为是光热疗法和化疗的协同效果所致。因此，所开发的Fe3O4@rGO@MSN不仅能利用起光热效应有效的消融癌细胞，还能将其作为药物载体有效的负载抗癌药物DOX进行化疗，实验结果表明，光热效应与化疗作用相结合得到的协同治疗效果，优于光热或化疗的单一效果。

（a）不同浓度Fe3O4@mSiO2纳米粒子与C6细胞共培养后的细胞存活率；（b）不同方法处理后的细胞存活：（Ⅰ）Control；（Ⅱ）NIR；（Ⅲ）Fe3O4@mSiO2；（Ⅳ）DOX/Fe3O4@mSiO2；（Ⅴ）DOX/Fe3O4@mSiO2+NIR

Fig.1 Cell viability tests：（a）Cell viability of co-cultivation of different concentrations of Fe3O4@mSiO2nanoparticles and cells；（b）Cell viability of different groups：（1）Control；（2）NIR；（3）Fe3O4@mSiO2；（4）DOX/Fe3O4@mSiO2；（5）DOX/Fe3O4@mSiO2+NIR

结语

本文采用热溶剂法制备磁性石墨烯纳米粒片，并利用溶胶凝胶法制备介孔硅包覆的磁性给石墨烯纳米片。对制备的介孔硅包覆的磁性给石墨烯纳米片的结构、光热性能和药物装载释放行为进行了表征和测试。通过形貌观察发现所得的介孔硅包覆的磁性给石墨烯纳米片为“三明治”片状结构。介孔硅的包覆具有以下几个优点：（1）在磁性石墨烯片层结构表面包覆介孔硅，在赋予石墨烯多孔功能的同时，又可提高磁性石墨烯片层结构的亲水性；（2）介孔硅表面的孔洞有利于提高OP的装载率，并可降低在体内循环的过程中的药物提前释放，对正常组织造成伤害；（3）当纳米载体到达病灶部位后，药物的释放速率可受到NIR影响。