日喀则地区穗花韭天然居群结实性状变异研究

吴海艳，旦增桑布，曲 珍，沈宝斌，王晓丽，崔建钊，拉巴顿珠，赖可，扎西平措，旦增旺布，刘鸿旭，杨时海，马玉寿*

(1.青海省畜牧兽医科学院/青海大学，青海 西宁 810016；2.日喀则市草原工作站，西藏 日喀则 857000；3.日喀则市科技局，西藏 日喀则 857000；4.西藏云旺实业有限公司，西藏 日喀则 857000)

乡土草是指自然生长于当地的植物，“近自然恢复”理论认为在青藏高原退化高寒草地恢复中乡土草种的种源不足是重要的制约因子，开发兼具生产功能和生态功能的乡土草种极为迫切[1]。种子繁殖是植物生存和发展的根本，也是乡土草种推广利用的先决条件[2]。因葱属植物在种植业、养殖业、园林造景中应用广泛[3-4]，近年来野生葱属植物引起了很多学者的关注[5-7]。穗花韭(MilulaspicataPrain)是百合科(Liliaceae)穗花韭属(Milula)的单种属植物，外形很象葱韭一类植物，有葱蒜味，但具有狗尾草似的密穗状花序，主要分布在西藏南部、尼泊尔、锡金和印度东北部，一般生于海拔2 900～4 800 m含沙质的草地、山坡、灌丛中或松林下[8-9]。由于穗花韭与葱属植物嵌套很深，穗花韭现已被更名为Alliumspicatum(Prain)N.Friesen[10]。它作为青藏高原的特有种，在西藏一直被当地群众作为野菜和调味品食用，并在食用、饲用、观赏、生态等方面具有较大的开发潜力[11]。

表型是在一定环境条件下，基因和环境共同作用的结果，表型性状多样性研究是植物遗传多样性研究的重要内容之一[12]。有学者对蒙古韭(A.mongolicum)、宽叶韭(A.hookeri)、碱韭(A.polyrhizum)、细叶韭(A.tenuissimum)等的结实特性进行了研究[13-16]，结果表明：干旱和人为干扰对种子产量影响较大，花序长度、花序宽度、小花数目等可作为葱属植物种质育种的选择指标。目前，已有文献对西藏拉萨、山南、日喀则等地的33个穗花韭居群在盛花期的遗传多样性[17]、矿质元素[18]和重金属含量[19]等进行了报道，而关于穗花韭在结实期的结实性状研究较少。由于受放牧和人为采挖等影响，穗花韭的野生生存环境受到了一定的破坏，资源呈减少趋势。因此，本研究拟通过对日喀则地区海拔3 800～4 600 m分布的16个穗花韭天然居群的结实特性进行研究，以期为穗花韭资源的保护和合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

样本踏查和采集在西藏日喀则地区进行，以文献报道的县乡分布点和生境为参考[8-9,17-19]，尽可能寻找新的县乡区域分布点。日喀则地区位于西藏自治区西南部，地理坐标为82°01′～90°20′E，27°13′～31°19′N，平均海拔在4 000 m以上，大致有三种气候特征：高原温带半干旱气候，高原亚寒带季风半干旱、干旱气候，高山亚热带气候。该地5至9月为雨季，年平均降雨量约270.5 mm～645.3 mm，无霜期在120 d以上[20]。草原可利用面积为1 242.13 万hm2，其中高寒草甸类面积最大，高寒草原类则是该地区最主要且具有高原地带性分布特征的草地类型之一[21]。

1.2 试验设计

在2021年9月通过踏查确定穗花韭分布较为集中的16个居群，进行花序采集和种子采集。调查地区的海拔梯度为3 832.5～4 624.90 m，经度范围为87.15～89.89° E，纬度范围为28.20～29.91° N。16个居群依次编号为NT，SJ，SC，LP，LQ，XR，XK，AQ，SM，KN，AK，NL，GL，KS，JJ，GG(表1)。环境数据来源于世界气候环境数据库(http://www.worldclim.org)中的19个气候变量(bioclim)，选取19个当前环境数据(Current，1970～2000年)，空间分辨率为30 arc-seconds resolution(1km分辨率栅格数据)(表2)。

表1 穗花韭居群信息

表2 本研究使用的气候因子

1.3 测定指标及方法

在确定的居群内选择穗花韭分布较为均匀的区域，由于研究区的穗花韭居群以单穗头花序为主，因此，每间隔10 m随机采集已成熟的密穗状花序10个为1组，共采3组作为3个重复。用游标卡尺测量每个花序的长、宽，并用电子秤称鲜重后做好标记，单独包装带回室内自然风干，称其干重，同时计数每个密穗状花序小花数，在此基础上随机选5朵小花计数每朵小花包含的种子粒数。此外，采集各居群的穗花韭成熟花序，带回室内自然风干后清选种子，测3次千粒重。

1.4 数据处理

试验数据采用Excel 2016对数据进行整理，用ArcGis10.4.1提取19个环境气候因子，用SPSS 20软件对数据进行描述性统计、Duncan’s多重比较、主成分分析和聚类分析，用Minitab 19对数据进行巣式方差分析，用R3.6.3制作相关性分析热图(用corrplot包)，用Excel 2016计算变异系数(CV)、表型分化系数(Vst)和Shannon-wiener指数(H)等[22-24]。将结实性状数据和环境气象因子数据做标准化处理后进行偏相关分析、相关分析、主成分分析(Principal component analysis,PCA)、聚类分析(采用Ward法，居群间遗传距离为平方Euclidean距离)[25-26]。

试验数据以“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 结实性状变异分析及遗传多样性

对16个穗花韭居群的穗鲜重、穗干重、花序长、花序宽、小花数、种子粒数、千粒重7个结实性状进行居群间的变异分析(表3)。结果表明：7个结实性状的变异系数为17.92%～74.18%，均值为42.40%，其中穗干重的变异系数最大(74.18%)，其变异幅度为0.04～2.10 g，其次是穗鲜重(61.32%)，小花数(56.40%)，花序长(41.34%)，花序宽(23.65%)，种子粒数(21.99%)，千粒重的变异系数最小(17.92%)。7个结实性状的Shannon-Wiener指数(H)在1.42～1.75之间，均值为1.59，其中穗鲜重的多样性指数最大(1.75)，其次是花序宽(1.68)，小花数(1.65)，千粒重(1.63)，花序长(1.56)，穗干重(1.43)，种子粒数的多样性指数最小(1.42)。7个结实性状穗鲜重(Spike fresh weight，SFW)、穗干重(Spike dry weight，SDW)、花序长(Inflorescence length，IL)、花序宽(Inflorescence width，IW)、小花数(Spikelet number，SPN)、种子粒数(Seed number，SEN)、千粒重(1 000-grain weight，TKW)的极大值和极小值的比值依次为32.28，52.50，12.50，4.75，20.29，4.50，2.20，平均为18.29。说明，居群间穗干鲜重和小花数的变异较大，且具有较高的进化或适应性潜力，同时，穗鲜重、花序宽、小花数、千粒重在个体水平上具有较为丰富的变异。

表3 穗花韭居群结实性状变异分析

对16个穗花韭居群的7个结实性状进行居群内的变异分析(表4)。结果表明：16个居群的变异系数在15.62%～33.72%之间，平均为25.99%。其中，GL变异系数最大(33.72%)，其次是XK(32.59%)，SM(29.54%)，LQ(27.86%)，NT(27.51%)，JJ(27.23%)，KN的变异系数最小(15.62%)；16个居群的Shannon-Wiener指数(H)在1.48～1.74之间，均值为1.60。16个居群的Shannon-Wiener指数(H)由高到低排序依次为：AK>GG>SJ>NL>LP>KN>AQ>SC>GL>SM>XR>KS>JJ>NT>LQ>XK。

表4 穗花韭居群结实特性变异系数和多样性指数

对16个穗花韭居群的7个结实性状进行巣式方差分析(表5)。结果表明，7个结实性状的表型分化系数在37.304%～82.353%之间，平均为55.492%。其中，千粒重的表型分化系数最大(82.353%)，其次是花序宽(58.974%)，花序长(55.712%)，穗干重(54.237%)，穗鲜重(51.852%)，小花数(44.370%)，种子粒数的表型分化系数最小(37.304%)。说明千粒重在居群间分化程度最大，其次是花序宽和花序长，而种子粒数的分化程度最小，穗花韭的7个结实性状变异中居群间的贡献为55.492%，居群内的贡献为44.508%，居群间的变异程度大于居群内的变异程度，即穗花韭结实特性变异的主要来源是居群间的变异。

表5 穗花韭居群结实特性的巣式方差分析和表型分化系数

对不同居群结实性状的Duncan多重比较结果见表6，7个性状在居群间存在不同程度的差异。NT的穗鲜重、穗干重、花序长、小花数均最大，分别为2.40 g，0.79 g，6.40 cm，195.33 粒，显著大于其余居群(P<0.05)；GL的花序宽显著宽于其余居群(P<0.05)，为1.12 cm；GL种子粒数为4.31粒，与GG，SM，KS的种子粒数差异不显著，但显著多于其余居群(P<0.05)；SM和NL的千粒重差异不显著，分别为0.95 g和0.93 g，但均显著高于其余居群(P<0.05)。

表6 穗花韭居群结实特性的均值、标准差及多重比较

2.2 穗花韭结实特性相关性分析

穗花韭居群间结实特性相关性分析结果(图1)表明，穗鲜重与穗干重、花序长、花序宽、小花数、种子粒数呈极显著正相关关系(P<0.01)，相关系数分别为0.89，0.95，0.62，0.91，0.47；穗干重与花序长、小花数、种子粒数呈极显著正相关关系(P<0.01)，相关系数分别为0.78，0.76，0.44，与花序宽呈显著正相关关系(P<0.05)；穗鲜重和穗干重均与千粒重呈负相关关系；花序长与花序宽、小花数、种子粒数呈极显著正相关关系(P<0.01)，相关系数分别为0.61，0.96，0.41；花序宽与小花数、种子粒数呈极显著正相关关系(P<0.05)，小花数与种子粒数呈显著正相关关系(P<0.05)；花序长、花序宽、小花数、种子粒数与千粒重呈正相关关系。说明，穗花韭花序长宽、小花数、穗鲜干重、种子粒数都对种子产量影响较大，但千粒重受其它结实性状的影响相对较小。

图1 穗花韭居群间结实性状相关分析

穗花韭居群内结实性状相关性分析结果(图2)表明，NT花序宽与穗鲜重呈极显著负相关关系(P<0.01)；SJ花序长和穗鲜重呈显著正相关关系(P<0.05)，花序宽和穗干重呈显著负相关关系(P<0.05)；SC,AK花序长和穗干重呈显著正相关关系(P<0.05)，SC,XR,NL千粒重和穗干重呈极显著正相关关系(P<0.01)，SC千粒重和花序长呈显著正相关关系(P<0.05)；LP小花数和穗鲜重呈显著正相关关系(P<0.05)；LQ穗干重和穗鲜重呈极显著正相关关系(P<0.01)，花序宽和花序长呈显著负相关关系(P<0.05)；XK,SM,KN各性状间的相关性没有达到显著水平；AQ穗干重、千粒重和穗鲜重呈显著正相关关系(P<0.05)，种子粒数和花序长、花序宽呈显著正相关关系(P<0.05)；GL种子粒数和穗干重呈极显著正相关关系(P<0.01)；KS千粒重和穗鲜重呈极显著负相关关系(P<0.01)；JJ花序宽和穗鲜重呈极显著正相关关系(P<0.01)，小花数和花序长呈显著负相关关系(P<0.05)；GG穗干重、花序宽和穗鲜重显著正相关关系(P<0.05)，千粒重和种子粒数呈极显著负相关关系(P<0.01)。说明，穗花韭不同的居群影响其结实的关键性状有所不同。

图2 穗花韭居群内结实性状相关分析

2.3 结实性状与环境气候因子的偏相关分析

穗花韭结实性状和环境气候因子的偏相关分析结果表明(图3)，除千粒重与经度，Bio2，Bio3，Bio7呈负相关关系外，其余6个性状均与其呈正相关关系。其中穗鲜重和Bio2，Bio7显著正相关关系(P<0.05)，穗干重和经度，Bio7显著正相关关系(P<0.05)，花序长和Bio7显著正相关关系(P<0.05)；除千粒重与纬度，Bio17，Bio19呈正相关关系外，其余6个性状与纬度，Bio17，Bio19呈负相关关系，但没有达到显著水平；穗鲜重、花序长和小花数与海拔呈负相关关系，穗干重、花序宽、种子粒数、千粒重与海拔呈正相关关系。其中，种子粒数与海拔呈显著正相关关系(P<0.05)，而与Bio1，Bio6，Bio11，Bio12，Bio13，Bio16，Bio18呈显著负相关关系(P<0.05)；7个结实性状均与Bio4呈正相关关系，但未达到显著水平；穗鲜重、花序长、小花数与Bio1，Bio5，Bio9，Bio10，Bio18呈正相关关系外，其它性状与其呈负相关关系，未达到显著水平；花序长、小花数与Bio11，Bio13，Bio16呈正相关关系外，其余性状与其呈负相关关系，未达到显著水平。表明在一定范围内，穗花韭结实性状受经度、海拔、温度和降水的影响较多，存在显著的地域差异。

图3 穗花韭结实性状与环境气候因子的偏相关分析

随着昼夜温差月均值(Bio2)和年温差(Bio7)增大，穗鲜重呈显著增加趋势；随着年温差增大，穗干重和花序长呈现出显著的增加趋势；随着经度增加，除千粒重外，其它结实性状均与经度呈正相关关系，尤其是穗干重表现出显著的增加趋势；随着海拔的升高，年均温(Bio1)、最冷月最低温(Bio6)、最冷季节平均温度(Bio11)、年均降水(Bio12)、最湿月降水(Bio13)、最湿季度降水量(Bio16)、最暖季度降水量(Bio18)下降，种子粒数呈增加趋势。结合结实性状相关性分析结果，种子粒数与穗鲜重、穗干重、花序长和花序宽的增加密切相关，即随着海拔和经度的增加，温差增大、温度降低、降水量减少，穗花韭则通过提高自己的繁殖性能表现出较强的适应性。

2.4 主成分分析

对16个穗花韭居群的7个结实性状进行主成分分析，按照主成分特征值大于1的原则，共提取到4个主成分，累计贡献率97.39%。第1主成分特征值4.36，贡献率62.25%，载荷较高的有穗鲜重、花序长、小花数；第2主成分特征值1.17，贡献率16.78%，第3主成分特征值0.83，贡献率11.79%，第2和第3主成分都是千粒重的载荷因子较高；第4主成分特征值0.46，贡献率6.58%，穗干重载荷因子较高。说明第1，4主成分基本反映了穗花韭密穗状花序生物量的信息，第2，3主成分基本反映了穗花韭种子质量的信息。

根据主成分综合得分(表7)，16个穗花韭居群得分由高到低依次为：NT>GG>SM>GL>NL>AK>KS>SJ>JJ>XK>KN>LP>SC>AQ>XR>LQ。

表7 穗花韭结实性状主成分分析

2.5 聚类分析

采用Ward法对16个穗花韭居群通过7个结实性状进行聚类分析，构建聚类树状图(图4)。结合本研究选育目标，当欧式距离为5时(图4虚线所示)，可将16个居群划分为4个类群。

图4 穗花韭居群聚类分析

第1类群为SJ，LP，XK，AK，KS，JJ，这类居群最大穗鲜重(KS，1.19 g)比平均值高14.29%，最大穗干重(KS，0.54 g)比平均值高40.74%，最大花序长(AK，3.97 cm)比平均值高17.13%，最大花序宽(SJ，0.88 cm)比平均值高6.82%，最大小花数(XK，112.70 个)比平均值高20.74%，最大种子粒数(KS，3.95 粒)比平均值高9.07%，最大千粒重(AK，0.80 g)比平均值高10.31%。

第2类群为SM，NL，GL，GG，这类居群最大穗鲜重(GG，1.51 g)比平均值高32.33%，最大穗干重(GG，0.52 g)比平均值高37.86%，最大花序长(GG，3.80 cm)比平均值高13.39%，最大花序宽(GL，1.12 cm)比平均值高26.51%，最大小花数(SM，112.63 个)比平均值高20.69%，最大种子粒数(GL，4.31 粒)比平均值高16.66%，最大千粒重(SM，0.95 g)比平均值高24.47%。

第3类群为AQ，KN，LQ，XR，SC，这类居群除最大千粒重(XR，0.82 g)和最大种子粒数(KN和AQ，3.72粒)高于平均值，最大花序宽(KN，0.82 cm)等于平均值外，最大穗鲜重、最大穗干重、最大花序长、最大小花数均低于平均值。

第4类群仅有NT。这类居群穗鲜重(2.40 g)比平均值高57.42%，穗干重(0.79 g)比平均值高59.10%，花序长(6.40 cm)比平均值高48.57%，花序宽(1.00 cm)比平均值高17.69%，小花数(195.33个)比平均值高54.27%，种子粒数(3.66 粒)比平均值高1.86%，最大千粒重(0.68 g)比平均值低5.51%。

综上，第4类群最优，其次是第2类群、第1类群，第3类群最差，可将第4类群和第2类群的5个居群作为今后引种驯化的重点材料，将第1类群的6个居群作为备选材料。

3 讨论

3.1 穗花韭结实性状的多样性及变异来源

种子是植物扩大种群空间的生命载体，其繁殖性能的高低是植物生存能力的体现[27]。花部综合特征是植物繁育系统中影响后代遗传性状的一个因素，花比其它繁殖器官具有更高的变异性[28]。花序上的小花数量的多少是影响种子产量的重要因素之一[29]。植物的表型变异系数可反应不同群体性状间的变异程度，对优良材料的选择具有重要意义，一般变异系数大于10%，说明该性状在种质个体间差距较大，变异系数越大，表明可选择的潜力越大[30]。本研究对成熟期的穗花韭穗状花序的鲜重、干重、花序长、花序宽、小花数、种子粒数、千粒重等7个结实性状进行居群间变异分析，得出7个性状的变异系数在17.92%～74.18%，其中穗干重的变异系数最大，其次是穗鲜重、小花数，花序长、花序宽，居群间存在极显著差异；16个居群内的变异系数在15.62%～33.72%之间，GL，XK，SM，LQ，NT，JJ的变异系数高于27.00%，说明这6个居群的变异较为丰富。Shannon-wiener指数(H)反映的是种质资源间性状的丰富及均匀程度[22]。本研究中居群间7个结实性状的Shannon-Wiener指数(H)在1.42～1.75之间，穗鲜重的多样性指数最大，其次是花序宽和小花数、千粒重、花序长；居群内的Shannon-wiener指数(H)在1.48～1.74之间，AK，GG，SJ，NL，LP的多样性指数高于1.65，说明这5个居群结实性状多样性较高。不同环境条件下，植物不同的表型性状的极大值和极小值的比值可在一定程度上反映出该性状的进化及对环境的适应性潜力[22]。本研究中穗干鲜重和小花数具有较高的进化和适应性潜力。综合居群内和居群间的变异系数、极值比值、Shannon-Wiener指数(H)和Duncan多重比较结果，本研究得出穗干鲜重和小花数变异最大，具有较高的适应潜力，居群间的变异大于居群内的变异，但Shannon-Wiener指数(H)在居群间和居群内相当，这与曹可凡[17]、李鸿雁等[14]的研究结果相似。居群NT，GL，SM，NL，GG可作为种质收集时的重点区域，而其它表现出较高变异的居群可有针对性的收集个体植株。

为进一步了解穗花韭居群间和居群内的变异情况和对环境的适应性，本研究通过巣式方差分析计算了7个结实性状的表型分化系数[23]，结果表明穗花韭居群间的贡献为55.492%，居群内的贡献为44.508%，居群间的变异程度大于居群内的变异程度，即穗花韭结实性状变异的主要来源是居群间的变异。

3.2 穗花韭结实性状的相关性及与环境气候因子的相关性

了解多个性状间的关联，有助于在多个性状中做优化选择[31]。牧草种子产量取决于各产量构成因素，千粒重是种子产量的重要因素之一，但在丰产研究中发现各类种子的千粒重变化不大[30]。在本研究中，穗花韭7个结实性状除千粒重外其它性状间大多存在显著或极显著相关关系[32]，尤其是穗鲜重与花序长宽，花序长与小花数的相关系数达到0.90以上，说明穗干鲜重、花序长宽、小花数是影响穗花韭结实的最关键性状，花序越大，小花数越多。种子量就越多。各居群内的结实性状相关分析表明，各居群与种子量相关的关键结实性状有所差异。植物生长受遗传因子和环境因子的双重影响[33]。如披碱草(Elymusdahuricus)居群遗传分化的最重要因素是地理位置(经度和纬度)[34]；沙葱因气候、土壤差异而形成了两种生态型，而水分条件是影响其种子量的制约因素[13,35]；在海拔相对较高、年均温相对较低、年均降水量相对较少的区域，野生羊草(Leymuschinensis)遗传多样性高于同质园栽培羊草[36]；昼夜温差交替更有利于多星韭(A.wallichii)和高葶韭(A.obliquum)的萌发[37-38]。在本研究中，也得到了类似的结果，7个结实特性与环境气候因子的相关性分析表明，昼夜温差和年温差与穗鲜重显著正相关，穗干重与经度显著正相关，种子粒数与海拔显著正相关，与年均温、最冷月最低温、最冷季节平均温度、年均降水、最湿月降水、最湿季度降水量、最暖季度降水量显著负相关，说明随着海拔升高和经度增加，温度降低的同时温差增大，降水量减少，为适应这种寒冷干燥的生存环境，穗花韭生育期随之缩短，在最暖季度和最湿季度快速进行营养生长，并将营养生长阶段积累的营养物质在生长后期尽可能较多的分配给生殖器官来完成生活史[39]，如穗花韭密穗状花序上每朵小花子房3室，每室具有的2胚珠发育成含6个种子的机率变大，种子的饱满度和硬度随之增加，加之适宜的温差有利于种子萌发，从而在一定程度上缓解恶劣环境对繁殖成功造成的压力，种群得以繁衍。植物结实能力的高低，是植物适应不良环境的基础[13]。在本研究中，海拔4 300～4 600 m穗花韭天然居群在结实性状上表现出对生境具有较好的适应性。

3.3 穗花韭结实性状的主成分分析和聚类分析

主成分分析通过降维处理较全面的衡量了每个性状在某个居群中所处的位置和分量，清楚的描述各因素在形态多样性构成中的作用，在此基础上，再根据各性状对居群进行聚类，两种分析方法的组合模式分析在种质分析及评价中应用效果较好[26,40]。曹可凡[17]对西藏拉萨、山南、日喀则分布的33个穗花韭居群的24个表型性状进行主成分分析和聚类分析，共提取到5个主成分，累计贡献率81.55%，并在欧氏距离4.83处将33个居群分为了4类。本研究就穗花韭的7个结实性状对16个居群进行了主成分分析，共提取到4个主成分，主要与密穗状花序生物量和千粒重性状有关，累计贡献率97.39%。结合选育目标，聚类分析在欧式距离为5时将这16个居群划分为4个类群，第4类群表现最优，其次是第2类群、第1类群、第3类群。

综合变异分析、主成分和聚类分析等结果，可将NT，SM，NL，GL，GG作为今后穗花韭选育的重点区域，将SJ，LP，XK，AK，KS，JJ作为进行个体选择的区域。

4 结论

本研究中16个穗花韭居群间的穗鲜重、穗干重、花序长、花序宽、小花数、种子粒数、千粒重7个结实性状存在极显著差异，居群间和居群内均存在较大的变异和多样性，但居群间的变异是穗花韭结实性状变异的主要来源。穗干鲜重、花序长宽和小花数是影响穗花韭结实的最关键性状。经度、海拔、温度和降水是影响穗花韭结实性状的主要环境因子，海拔4 300～4 600 m的穗花韭野生居群对环境表现出较好的适应性。综合来讲，居群NT，SM，NL，GL，GG可选育潜力较大。