相对饲养水平对绵羊肌肉组织结构及肌纤维组成相关基因的影响

宋淑珍，高良霜，李宏，宫旭胤，刘立山，魏玉兵

相对饲养水平对绵羊肌肉组织结构及肌纤维组成相关基因的影响

宋淑珍1，高良霜2，李宏3，宫旭胤1，刘立山1，魏玉兵4

1甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所，兰州 730070；2甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070；3呼图壁县农业农村局，新疆呼图壁 831200；4平山湖蒙古族乡畜牧兽医站，甘肃张掖 734000

【目的】提高肉品质是现代肉羊生产的主要目标之一，研究不同饲养水平对阿勒泰羊背最长肌肌肉组织结构及肌纤维组成相关基因的影响，为通过饲养水平调控肉脂型绵羊肉品质，提高生产效益提供参考。【方法】选择出生日龄接近（（3.0±0.5）月龄）、体况良好、体重相近（（19.16±0.54）kg）、臀型一致的阿勒泰羊30只，随机分为3组，自由采食60 d后，分别按照50%（0.25 MJ/W0.75×d-1）（NL组）、100%（0.5 MJ/W0.75×d-1）（NM组）、150%（0.75 MJ/W0.75×d-1）（NH组）的维持代谢能饲喂30 d后屠宰，取背最长肌分别进行苏木精—伊红(H.E.)染色和2%醋酸铀-枸橼酸铅双染色法染色，光学显微镜和透射电镜观察肌肉组织结构，并通过免疫组化法测定肌球蛋白重链I (myosin heavy chain，MyHC I)和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（preoxisome proliferator-activated receptorgamma，PPARγ）蛋白表达量。【结果】(1)阿勒泰羊摄入50%、100%和150%的维持代谢能时，三组试验羊的平均日增重分别为-90.67 kg、13.33 kg和203.00 kg，差异显著(＜0.05)；背最长肌肌纤维直径NH组、NM组显著大于NL组（＜0.05）；肌内膜厚度NH组显著小于NL组（＜0.05）；肌束肌纤维数量、肌束纤维面积、肌束膜厚度以及肌纤维面积、肌纤维密度差异不显著（＞0.05）。(2)饲养水平对肌质网终池面积、脂滴面积以及肌质网终池、肌原纤维、肌质的面积比都有影响，肌质网终池面积和面积比NH组显著大于NM和NL组（＜0.05），脂滴面积NH组显著大于NL组（＜0.05）；肌质面积比NM组显著大于NH和NL组（＜0.05）；线粒体、糖原三组之间无显著差异（＜0.05）。(3)饲养水平对肌纤维组成相关基因蛋白的表达有影响，PPARγ的蛋白表达强度、阳性面积和阳性率NL和NM组显著低于NH组（＜0.05）；MyHCⅠ蛋白表达强度随能量摄入水平的增加而增大，但是三组间差异不显著（＞0.05）。【结论】不同饲养水平对阿勒泰羊背最长肌肌肉组织结构和肌纤维类型相关基因蛋白的表达具有显著的影响，在育肥期可通过饲养水平控制肌肉组织结构和肌纤维类型组成，从而按照生产需要调控肉品质。

相对饲养水平；肉品质；肌肉组织结构；肌纤维；PPARγ；MyHC I；阿勒泰羊

0 引言

【研究意义】降低养殖成本和生产高品质羊肉是现代肉羊养殖业的两大主要目标，羊肉的品质主要受羊的品种、年龄、性别、营养、管理水平等因素影响，而肌纤维是肌肉组织的基本单位，肌纤维的组织结构特征是肉品质性状形成的基础[1]，与肉的质构特性和嫩度、色泽、保水性等理化性状密切相关，是肉品质和肌肉生长状况的重要决定因素[2-3]。在畜禽养殖业中，骨骼肌的肌纤维结构组成及其调控已成为国内外研究肉品质的调控的重点。【前人研究进展】肌肉组织中，肌纤维所占比例在75%—90%之间，数量在动物出生时已经固定，根据功能特征可分为慢速氧化型（Ⅰ型）、快速氧化-酵解型（ⅡA型）和快速酵解型（ⅡB型）3种[4-5]，3种不同类型的肌纤维在动物不同组织部位含量不同[6]，不同类型肌纤维的数量比例、密度及长度直接影响着肌肉的代谢特征及品质[7]，Ⅰ型肌纤维也叫肌红纤维，富含肌红蛋白，具有高氧化和低糖酵解的代谢特性，与肌肉的亮度（L*）和红度（a*）正相关，与剪切力、滴水损失负相关[8]。同时，Ⅰ型肌纤维比例较高的肌肉由于具有较高的氧化代谢水平，其自由氨基酸含量也较高，而自由氨基酸有助于提高肉的风味[9]。肌纤维类型也与肌内脂肪的沉积密切相关，不同肌纤维类型的肌内脂肪含量依次为Ⅰ＞Ⅱa＞Ⅱx＞Ⅱb，而肌内脂肪含量影响肌肉的嫩度、多汁性和风味[10]。营养摄入是影响肌纤维特性的重要因素之一，与正常饲喂组相比，限饲可抑制育肥猪肌纤维直径的增大[11]，ⅡB型肌纤维减少，ⅡA型纤维增加[12-13]。肌球蛋白重链Ⅰ（Myosin heavy chainⅠ，MyHCⅠ）和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（preoxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）是肉品质的主要调控因子，在促进成肌细胞分化、肌纤维类型的转换[14]和肌内脂肪沉积等方面发挥着重要的调控作用。【本研究切入点】目前，我国肉羊产业在注重育肥效率的同时，人们开始关注羊肉品质，但对羊肉的营养调控研究主要集中在饲粮某一营养成分，如蛋白水平、来源以及各种添加剂等的影响方面，且主要涉及羊肉常规营养成分、脂肪和脂肪酸含量、氨基酸、风味化合物以及嫩度等的影响研究，而羊肉的嫩度等理化性质主要由其组织结构决定。饲养水平对羊肉组织结构的影响尚未见系统报道。【拟解决的关键问题】本研究以肉脂兼用型绵羊阿勒泰羊为动物模型，探讨不同饲养水平对其肌肉肌纤维和肌束膜结构特性及肌纤维之间的肌质网、线粒体、脂滴、糖原等的影响，并通过免疫组化法，对MyHCⅠ和PPARγ蛋白的表达量进行分析，为通过饲养水平调控肉脂兼用型羊生产提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2019年8月1日至2019年10月30日在甘肃省张掖市甘州区平山湖良种繁育场进行，种羊繁育场地处东经100°6′—100°52′，北纬38°32′—39°24′之间，年平均气温7.8℃，平均海拔1 475.8 m。

1.2 试验动物与试验设计

挑选月龄相近（（3.0±0.5）月龄）、体重接近（（19.16±0.54）kg）、健康状况良好的阿勒泰羔羊30只，随机分为3组，每组10个重复，每个重复一只羊，自由采食60 d，三组羊体重分别达到（30.17± 1.17）kg、（30.75±1.72）kg 和（30.83±1.16）kg 时，参照NRC（2007）相应体重羊维持能量需要和Fernandes等[15]育成羊（20—35 kg）的维持能量需要，通过控制试验羊采食量，分别按照50%（0.25 MJ/W0.75×d-1）（NL组）、100%（0.5 MJ/W0.75×d-1）（NM组）和150%（0.75 MJ/W0.75×d-1）（NL组）的维持代谢能饲喂30 d[16]。每隔10 d对试验羊空腹称重，并根据体重和能量需要量调整饲粮喂量。试验结束后每组选取9只羊屠宰取背最长肌样品用于后续试验。

1.3 试验动物饲养管理

试验前一周，对羊舍、羊栏、食槽等进行打扫、消毒，一周后转入试验羊群，试验前对试验羊进行称重，打耳号、驱虫并进行分组。单栏饲养，羊舍温度、光照、通风等饲养环境条件一致。每天上午7：00、下午16：00分两次饲喂，自由饮水。试验日粮根据美国 NRC（2007）肉用绵羊营养需要配制，试验期日粮的组成、营养水平见表1。

表1 试验日粮组成及营养水平（干物质基础）

1)预混料为每千克饲粮提供：锰 15 mg，铁 12 mg，锌 24 mg，铜 2.4 mg，钴 0.4 mg，碘 0.4 mg，硒 0.1 mg，维生素 A 1350 IU，维生素 D3450 IU，维生素 E 30 IU。2)消化能、代谢能按照文献[17]中公式计算而得，其余为实测值

1)The premix provided the following per kg of diets:Mn 15 mg, Fe 12 mg, Zn 24 mg, Cu 2.4 mg, Co 0.4 mg, I 0.4 mg, Se 0.1 mg, VA 1350 IU, VD3450 IU, VE 30 IU.2)DE, ME were calculated according to the formula in reference[17], while the others were measured

1.4 测定指标与方法

1.4.1 组织学测定 肌纤维数量、直径、面积以及肌内膜和肌束膜厚度：采用石蜡切片，苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining，H.E.）染色法，羊屠宰后垂直于肌纤维取1 cm×1 cm×0.5 cm左侧12与13肋骨间的背最长肌1—2块，用4%多聚甲醛溶液固定，带回实验室固定1—2 d，修剪成大小为0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm的样品，按常规步骤脱水浸蜡包埋。包埋好的组织样品置于-20℃冷冻数分钟后，垂直于肌纤维切成4—5 μm厚的薄片，将切片小心贴附于载玻片上，放入展片器展片并烤片。然后进行H.E.染色，将组织切片常规脱蜡至水。流水水洗1 min，苏木精液染色5 min，流水洗去苏木精液1 min，1%盐酸酒精2 s，流水水洗2 s，促蓝液返蓝10 s，流水冲洗20 s，0.5%伊红液染色3 min，蒸馏水稍洗2 s，80%、95%乙醇各脱水20 s，100%乙醇2 s，二甲苯（Ⅰ）和二甲苯（Ⅱ）2 s，中性树胶封固。肌纤维的观察参考陈圆等[18]的方法并作适当修改，在10×40倍显微镜下观察，每张切片随机选择3个视野，用专业图像分析软件（Image-Pro Plus 6.0）分析，每个视野选取1—2个完整肌束，观察肌束膜、肌内膜厚度，选定一个完整肌束的所有肌纤维观察肌纤维数量，并测定肌纤维长径、短径，计算平均直径和横截面积（面积=长径×短径×0.7)[19-20]。

肌纤维超微结构：采用铀-铅双染色，透射电镜观察法，羊屠宰后取5 mm×5 mm×5 mm左侧12肋骨与13肋骨间的背最长肌1—2块，用4℃的2.5%戊二醛固定24 h。双蒸水漂洗3次，每次30 min；用1%锇酸避光室温下固定1.5 h；再双蒸水漂洗3次，每次30 min；50%、70%、100%的乙醇梯度脱水2次，每梯度脱水10 min；采用叔丁醇真空干燥法干燥，先用75%叔丁醇处理30 min，再用100%叔丁醇处理两次，每次10 min；然后依次用丙酮﹕环氧树脂（2﹕1），丙酮﹕环氧树脂（1﹕1）和环氧树脂37℃恒温渗透，每次渗透10 h；沿肌纤维方向切成80 nm厚的薄片；用2%醋酸铀饱和水溶液，枸橼酸铅进行铀-铅双染色，然后真空干燥，离子镀膜仪镀膜，用透射电镜扫描观察肌质网终池、线粒体、糖原等的面积。

1.4.2 免疫组化 常规石蜡切片放入盛满柠檬酸缓冲液（pH=6.0）的修复盒，微波炉内中火8 min至沸，停火保温8min再转中低火7 min，自然冷却后将切片置于磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS，pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min进行抗原修复；切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min阻断内源性过氧化物酶；切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，在组化圈内滴加3%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭30 min；轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的PPARγ、MyHCⅠ抗体，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜；切片置于PBS（pH7.4）中洗涤3次，每次5 min，稍甩干后在圈内滴加山羊抗兔IgG，室温孵育50 min；切片再用PBS洗涤3次，每次5 min，稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液显色；苏木素复染细胞核；酒精梯度脱水，中性树胶封片，通过图像分析系统观察分析PPARγ、MyHCⅠ蛋白平均光密度值。

1.5 数据处理与统计分析

运用 SPSS 软件（IBM SPSS Statistics 19）中ANOVA统计，用LSD进行差异显著性检验。所有数据以平均值±标准误（Mean±SE）表示，显著水平为0.05（＜0.05）。

2 结果

2.1 饲养水平对阿勒泰羊生长性能的影响

由表2可知，不同饲养水平开始时，3组羊体重分别为（30.17±1.17）kg、（30.75±1.72）kg 和（30.83± 1.16）kg，3组试验羊初始体重无显著性差异（＞0.05），经过30 d 的不同饲养水平饲喂后，3组之间的末重、平均日增重都存在显著差异，3组试验羊的平均日增重分别为203.00 kg、13.33 kg和-90.67 kg，NH组的末重、平均日增重显著高于NM组和NL组（＜0.05）；NL组的末重、平均日增重显著低于NM组和NH组（＜0.05）。

表2 饲养水平对绵羊生长性能的影响

同行数据无字母表示差异不显著（＞0.05），不同小写字母表示差异显著（＜0.05），下同。生长性能数据引自团队成员李宏等[16]

In the same row, values with no letter mean no significant difference (＞0.05), while with different small letter mean significant difference (＜0.05). The same as below. The growth performance data from team member Li Hong et al.[16]

2.2 饲养水平对阿勒泰羊背最长肌肌纤维结构的影响比较

不同饲养水平对阿勒泰羊背最长肌显微结构观测结果如表3所示，其H.E.染色图片如图1所示。由表3可知，阿勒泰羊每天摄入50%、100%和150%的维持代谢能的营养水平时，背最长肌的肌束肌纤维数量、肌束纤维面积、肌束膜厚度以及肌纤维面积、肌纤维密度差异不显著（＞0.05）；肌纤维最长直径、肌纤维最短直径NH组显著大于NL组（＜0.05）；肌纤维直径NH组、NM组显著大于NL组（＜0.05），NH组和NM组无显著差异（＞0.05），仅在数值上NM组小于NH组；肌内膜厚度NH组显著小于NL组（＜0.05），NM组与NH组、NL组无显著差异（＞0.05）。

透射电镜拍摄的阿勒泰羊背最长肌肌原纤维超微结构如图2所示，肌质中含有肌原纤维、线粒体、糖原颗粒、脂滴、肌质网等，线粒体分布于肌纤维四周，体积较大，且形状不太规则。糖原颗粒主要分布在肌原纤维间隙中，呈比较集中的小颗粒状，占去肌原纤维间隙的大部分。脂滴主要呈不规则、大小不等的圆形，染色较浅，且NH组、NM组脂滴数量比NL组多、体积大。肌纤维量化指标见表4，由表4可知，饲养水平对肌纤维超微结构也有影响，阿勒泰羊每天摄入50%、100%和150%的维持代谢能的营养水平时，肌质网终池面积、脂滴面积以及肌质网终池、肌原纤维、肌质的面积比都会发生变化，肌质网终池面积和面积比NH组显著大于NM和NL组（＜0.05），脂滴面积NH组显著大于NL组（＜0.05），NM和NL组差异不显著（＞0.05）。肌原纤维和肌质面积比NM组显著大于NH和NL组（＜0.05），而NH组和NL组无显著差异（＞0.05）。线粒体、糖原三组之间无显著差异（＞0.05）。

图1 阿勒泰羊背最长肌肌纤维显微结构图(×400)

图2 阿勒泰羊背最长肌肌纤维超微结构图

2.3 饲养水平对阿勒泰羊背最长肌PPARγ、MyHCⅠ蛋白表达的影响

图3、图4分别为阿勒泰羊背最长肌MyHCⅠ、PPARγ的免疫组化图，蓝色为细胞核，棕黄色为阳性表达，相关基因蛋白表达强度用光密度值标准化，蛋白表达强度量化指标见表5，阿勒泰羊每天摄入50%、100%和150%的维持代谢能营养水平时，对PPARγ基因的蛋白表达强度有影响，NL和NM组PPARγ的蛋白表达强度、阳性面积和阳性率显著低于NH组（＜0.05），NM和NL组差异不显著（＞0.05），PPARγ的IOD 3组之间无显著差异（＞0.05）。MyHCⅠ基因的蛋白表达强度随饲养水平摄入量的增加而增大，但是3组间差异不显著（＞0.05）。

图3 阿勒泰羊背最长肌肌纤维MyHCⅠ免疫组化图

图4 阿勒泰羊背最长肌肌纤维PPARγ免疫组化图

表3 饲养水平对阿勒泰羊背最长肌肌纤维显微结构的影响

表4 饲养水平对阿勒泰羊背最长肌肌纤维超微结构的影响

肌质网终池面积比=肌质网终池面积/（肌质网终池面积+肌原纤维面积+肌质面积），肌原纤维面积比=肌原纤维面积/（肌质网终池面积+肌原纤维面积 +肌质面积），肌质面积比=肌质面积/（肌质网终池面积+肌原纤维面积+肌质面积），线粒体面积比=线粒体面积/（线粒体面积+肌糖原面积+脂滴面积），肌糖原面积比=肌糖原面积/（线粒体面积+肌糖原面积+脂滴面积），脂滴面积比=脂滴面积/（线粒体面积+肌糖原面积+脂滴面积）

Area ratio of terminal cisternae = terminal cisternae area /( terminal cisternae area + myofibril area + sarcoplasm area), area ratio of myofibril = myofibril area /( terminal cisternae area + myofibril area + sarcoplasm area), area ratio of sarcoplasm = sarcoplasm area /( terminal cisternae area + myofibril area + sarcoplasm area), area ratio of chondriosome = chondriosome area /( chondriosome area + glucogen area + lipid area), area ratio of glucogen = glucogen area /( chondriosome area + glucogen area + lipid area), area ratio of lipid =lipid area /( chondriosome area + glucogen area + lipid area)

表5 饲养水平对阿勒泰羊背最长肌肌PPARγ、MyHCⅠ蛋白表达的影响

IOD=像素总数N（4088×3072）×平均光密度（软件计算值），蛋白表达强度（光密度值）=IOD/N

IOD=total number of pixels N (4088×3072)×average optical density (software value), Protein expression intensity (Optical density value)=IOD/N

3 讨论

3.1 饲养水平对肌肉组织结构的影响

肌肉组织结构主要包括肌原纤维和结缔组织，肌原纤维是构成肌肉组织的基本单位，在动物胚胎期形成，其数量出生后基本不再发生变化[2]。肌原纤维之间含有大量结缔组织肌束膜、肌内膜等，能够在一定程度上阻止肌肉内水分蒸发和汁液外渗，增强肌肉持水力。肌纤维是肉品质研究的一项重要内容。肌纤维类型、直径、密度等受品种、年龄、性别、营养水平、激素等多种因素的影响[21]，肌纤维是影响肌肉嫩度、质构特性、肉色和pH值的重要指标[22-24]。Bee等[11]研究表明，限饲可抑制猪背最长肌肌纤维直径的生长，而对肌纤维组成的影响则取决于猪的生理阶段。Asghar等[25]研究结果认为，能量负平衡使羔羊背最长肌肌原纤维直径和肌节长度显著降低；肌质网、线粒体、糖原颗粒在羔羊背最长肌中均呈稀疏状态呈现，其中肌质网与能量供给无关，而肌糖原、线粒体、脂肪颗粒数量和大小随着能量的降低而减小。王震等[26]分别用100%、85%、70%和55%能量饲喂湖羊发现，随着能量水平的降低，肌纤维面积减小，背最长肌肌纤维面积100%能量组显著大于其他各组，70%和55%能量组之间无显著差异；肌纤维密度70%和55%能量组显著低于100%和85%能量组。张崇志等[27]的研究结果也认为，限制能量和蛋白质对肌纤维直径、面积和密度具有显著影响，随着后期补偿期营养的充足补给，这种由营养限制造成的肌纤维差异消除。

本研究结果表明，饲养水平对阿勒泰羊背最长肌肌束肌纤维数量、肌束纤维面积、肌束膜厚度以及肌纤维面积、肌纤维密度、线粒体、肌糖原等均无显著影响，但肌纤维平均直径、肌内膜厚度、肌质网终池、脂滴等的面积都受饲养水平的影响。这可能是肌束肌纤维数量在动物胚胎期已经形成，出生后只是肌纤维的增粗和肌节增长[2]，其数量不受饲粮营养水平、饲养方式和管理措施等的影响。线粒体和糖原是骨骼肌细胞中负责重要生理功能的细胞器，线粒体是细胞中制造能量的结构，在I型肌纤维中含量丰富[28]，是细胞进行有氧呼吸、糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的主要场所，而糖原是储存能量的主要场所，两者对维持动物正常的生命活动具有不可或缺的重要作用，因此，在营养限制未超过一定极限幅度时保持基本生命活动的细胞器不受影响，可能在能量摄入达到一定的极限值时，这些重要的细胞器也会受到影响。肌内膜和肌束膜都是由波状胶原纤维构成的网状结构，一方面对肌肉组织起支撑、限制扩张作用，是肌肉力量传递的基本元素；另一方面，是肌纤维横截面积的增加的重要因素，与肉的嫩度、持水力等正相关[29]。本研究中肌束膜厚度不受饲养水平的影响，而肌内膜厚度随饲养水平增加反而减小，肌纤维平均直径随饲养水平的增加而增大，这说明随着饲养水平的增加，肌纤维生长增粗、横截面积增大，从而促进肌肉组织的生长发育，而肌内膜最主要的作用可能是支撑肌肉组织、限制肌肉扩张。肌质网终池内有与钙离子结合的物质，通过对钙离子的贮存、释放和再聚积调节肌浆内钙离子浓度，从而触发和终止肌原纤维的收缩，参与肌肉收缩活动；脂滴是细胞脂质代谢的中心，储存中性脂类，调控脂滴的新生、生长、融合以及降解[30]。本研究结果也显示，肌质网终池和脂滴所占的面积随着饲养水平的增加而增大，这说明随着饲养水平的增加，肌肉组织细胞器肌质网终池参与肌肉收缩的调节能力和脂滴调节脂质合成代谢增强。

3.2 饲养水平对肌纤维类型调控相关基因蛋白表达的影响

骨骼肌依据肌纤维代谢和收缩特点，可分为慢速氧化型（Ⅰ型）、快速酵解型（Ⅱ型）和氧化－酵解混合型[4-5]；根据肌纤维所含肌球蛋白重链的不同，可分为Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx和Ⅱb 4种[22]，肌纤维类型按照Ⅰ↔Ⅱa↔Ⅱx↔Ⅱb的变化规律相互转化。不同类型的肌纤维具有不同的肌球蛋白 ATPase 活性、糖原含量以及糖酵解潜力，并对宰后肌肉的pH值、肉色、系水力、嫩度等肉品质指标有较大影响[2-3]。MyHC I与肉色、肌内脂肪、嫩度和系水力等指标呈正相关，MyHC Ⅱb与剪切力、蒸煮损失等指标正相关，MyHC Ⅱb含量高的肉糖酵解速率快、乳酸含量高，pH值下降快，肉品质较差[31-32,13]，而饲粮营养水平是影响肌纤维转化的重要营养因子可以调节肌纤维的组成。Wang等[33]研究结果显示，育肥湖羊公羔随着摄入饲粮代谢能水平的增加，股二头肌中MyHC-IIa、MyHC-IIx的mRNA表达量显著降低，而能量水平对MyHC I、MyHC-IIb的影响不显著。ALMURSHED等[34]研究了73%、81%和100%能量饲喂对雄性大鼠的比目鱼肌肌纤维类型的影响，结果显示，不同能量摄入时大鼠跖肌和比目鱼肌中MyHC I、MyHC IIa、MyHC IIx 和MyHC IIb的表达差异不显著，即短期能量限制对肌纤维分型无影响。本试验结果表明，在试验中，阿勒泰羊分别摄入50%、100%和150%的维持代谢能饲喂时，背最长肌MyHCⅠ的蛋白表达强度随能量摄入水平的增加而增大，但是三组之间差异不显著。这与以上研究结果相似。

PPARγ是由配体激活的核转录因子PPARs的一员，在脂肪代谢和脂肪细胞的分化方面具有决定性的作用，是脂肪细胞分化的开关，在促进肌内脂肪沉积中具有重要的作用[35-36]。有研究者为探究PPARγ基因在骨骼肌脂肪沉积和纤维形成中的作用，通过克隆PPARγ使其在猪的肌肉中特异性过表达。结果显示，PPARγ转基因猪的肌内脂肪含量显著增加，脂肪酸氧化代谢增强，氧化型肌纤维相关基因如MyHC1和TNNT1的表达增强，这说明PPARγ可能在肌纤维类型转换中起重要作用，可促进氧化纤维（MyHC I）形成和肌内脂肪沉积[37-39]。王小芳等[40]研究了饲粮能量和蛋白水平对滩羊脂肪组织PPARγ mRNA表达的影响，结果表明，当蛋白水平较低时，高能量饲粮可以显著提高滩羊PPARγ mRNA的相对表达量；但当蛋白水平较高时，由于提高了机体热增耗，从而使能量的相对利用率降低，高能量水平反而降低了PPARγ 的表达。宋洪新等[41]的研究也认为，高能量饲粮饲喂幼龄獭兔可使肝脏PPARγ mRNA表达量提高，这些都与本试验的研究结果相似。

4 结论

在本试验条件下，相对饲养水平显著影响阿勒泰羊背最长肌肌纤维直径、肌内膜厚度、肌质网终池面积、脂滴面积以及肌质网终池、肌原纤维、肌质的面积比等肌肉组织结构。

适度的饲粮高饲养水平能提高PPARγ、MyHCⅠ蛋白表达强度，促进Ⅰ性肌纤维的合成。

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Effects of Feeding Levels on Muscle Tissue Structure and Muscle Fiber Composition Related Genes in Sheep

SONG ShuZhen1, GAO LiangShuang2, LI Hong3, GONG XuYin1, LIU LiShan1, WEI YuBing4

1Institute of Animal and Pasture Science and Green Agriculture, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070;2College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070;3Agricultural and Rural Bureau of Hutubi, Hutubi 831200, Xinjiang;4Animal Husbandry and Veterinary Station of Pingshanhu, Zhangye 734000, Gansu

【Objective】Improving meat quality is one of the main goals of the modern mutton sheep production. The objective of this study was to compare the muscle tissue structure and the genes expression related muscle development of longissimus dorsi muscle in Altay sheep, so as to provide the reference for regulating meat quality and improving production efficiency of meat-fat type sheep by feeding level. 【Method】Thirty Altay female lambs with a similar month ((3.0±0.5) months), similar body weight ((19. 16±0.54) kg), uniform tail size were randomly divided into 3 groups with 10 lambs per group. After 60 days of ad libitum feeding, three test sheep groups were fed with 50% (0.25 MJ/W0.75×d-1, NL group), 100% (0.5 MJ/W0.75×d-1, NM group), and 150% (0.75 MJ/W0.75×d-1, NH group) maintenance metabolizable for 30 days, respectively, and then slaughtered. The longissimus dorsi muscle was stained with Hematoxylin Eosin (HE staining) and 2% uranyl acetate-lead citrate double staining, respectively, and then the expression of myosin heavy chain I (MyHC I) and peroxisome receptor activator-activated gamma (PPARγ) was determined by immunohistochemistry. 【Result】(1) When Altay sheep were fed 50%, 100% and 150% metabolizable energy, respectively, the difference of average daily gain was significant (＜0.05), and the difference of three groups were -90.67 kg, 13.33 kg and 203.00 kg, respectively. The diameter of longissimus dorsi muscle fibers from NL group and NH group was significantly larger than that from NL group (＜0.05), while the thickness of muscular intima from NH group was significantly smaller than that in NL group (＜0.05), but there were no significant differences in the amount of muscle fiber, the area of muscle fiber, the thickness of muscle fascicle, the area of muscle fiber and the density of muscle fiber (＞0.05). (2) The feeding levels affected the area of terminal cisterna, lipid droplets and the area ratio of terminal cisterna, myofibril and sarcoplasm. The area and area ratio of terminal cisterna from NH were significantly larger than those from NM group and NL group (＜0.05), while the area of lipid droplets from NH group was significantly larger than that from NL group (＜0.05). The area ratio of sarcoplasm from NM group was significantly larger than that from NH and NL Group (＜0.05), and mitochondria and glycogen had no significant difference among the three groups (＜0.05). (3) The feeding levels affected the expression of gene related muscle fiber, PPARγ expression intensity, positive area and positive rate from NL, and NM groups were significantly lower than those from NH group (＜0.05). The expression intensity of MyHC Ⅰ protein increased with the increase of feeding level, but there was no significant difference among three groups (＞0.05).【Conclusion】The feeding level had a significant effect on the muscle tissue structure and the expression of gene protein related to muscle fiber type of the Longissimus dorsi muscle in Altay sheep, and it could be used to control the muscle tissue structure and muscle fiber type composition during fattening period, in order to regulate the quality of meat according to production needs.

feeding level; meat quality; muscle tissue structure; muscle fiber; PPARγ; MyHC I;Altay sheep

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.21.016

2021-09-03；

2021-12-20

国家自然科学基金（31960673）、甘肃省自然科学基金（21JR1RA362）、甘肃省农业科学院重点研发计划（2021GAAS15）

宋淑珍（通信作者），E-mail：songshuzhen@gsagr.ac.cn

（责任编辑 林鉴非）