‘黑比诺’葡萄不同叶龄叶片叶绿体内淀粉积累及其相关基因表达差异分析

尤佳玲，李有梅，孙孟豪，谢兆森

‘黑比诺’葡萄不同叶龄叶片叶绿体内淀粉积累及其相关基因表达差异分析

尤佳玲，李有梅，孙孟豪，谢兆森

扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009

【目的】随着叶龄的增长，葡萄叶片叶绿体内淀粉积累增加，但是调控其淀粉积累的分子机理还未见报道，本研究通过筛选参与调控淀粉积累的潜在基因，阐明葡萄不同叶龄叶片叶绿体中淀粉积累的分子机理。【方法】以2年生‘黑比诺’(Pinot Noir)葡萄为试材，观察不同叶龄叶片叶绿体内淀粉积累动态，并采用高通量测序技术进行转录组分析，筛选出与淀粉和蔗糖代谢途径相关的关键酶基因，同时采用实时荧光定量PCR技术对关键基因进行表达验证。【结果】未展开叶（NL）叶绿体内淀粉粒体积较小，积累量少，随着叶龄增长，在生长中叶（GL）和成熟叶（ML）叶绿体内，淀粉粒体积明显增大，积累量增加。转录组测序共得到58.57 GB的有效数据，KEGG富集分析表明，与NL相比，在GL和ML中差异表达的基因显著富集于淀粉与蔗糖代谢通路。分析该通路基因表达模式发现，细胞壁转化酶（cell wall invertase,）、磷酸葡萄糖变位酶（Phosphoglucomutase，）、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，）等基因参与蔗糖转化为淀粉合成前体腺苷二磷酸葡萄糖（adenosine diphosphate glucose，ADPG）的过程，且随叶龄增大逐渐上调表达；可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase，）、淀粉分支酶（starch branching enzyme，）、α-淀粉酶（α-amylase，）、β-淀粉酶（β-amylase，）等基因参与淀粉合成与水解过程，同样随叶龄增大上调表达，其中、在半结晶结构支链淀粉合成中起重要作用。【结论】随着叶龄的增大，叶绿体中淀粉积累增加；等基因可能是参与调控叶绿体内淀粉积累的关键基因。

黑比诺；转录组；叶龄；淀粉；淀粉代谢

0 引言

【研究意义】葡萄（L.）为葡萄科葡萄属植物，是一种世界性水果，果实可鲜食或酿酒[1]。葡萄成熟叶片是进行光合作用的主要场所，也是重要的源器官，与果实（库）生长和品质形成关系密切。叶龄是衡量叶片生命活动长短的标尺[2]，随着叶龄的增长，叶片的结构与功能都会发生变化，其中叶绿体是决定其功能的重要细胞器，而叶绿体内淀粉的合成与积累反馈调节叶片光合作用和光合产物输出。葡萄利用淀粉分解来产生具有抗寒性的代谢物和能量，地上部（叶片与藤蔓）淀粉积累决定着生长季后期抗性与冬季抗性[3]。因此，研究不同叶龄叶片淀粉代谢积累情况对探究叶片同化物分配规律、改善果实品质以及提高逆境抗性具有重要意义。【前人研究进展】葡萄叶片在整个生长季节内持续向贮藏组织提供光合产物，不合理的冠层管理与病理落叶会损害光合产物储备，进而影响下一季的营养生长与生殖生长[4]。叶龄作为叶片生命进程的指标，反映叶片从出现、展叶到迅速扩展、成熟、衰老直至最后脱落的过程[5]。未展开叶（库器官）内部结构还未发育完整，光合作用效率低，产生的光合物不能满足自身生长发育，还需要其他功能源叶提供同化物；随着叶龄的增大，叶片由库器官转化成源器官，制造的光合产物经韧皮部装载输出至其他库器官，同时未能及时输出的光合产物会以淀粉的形式储存在叶绿体淀粉粒中，这部分淀粉被称为暂时性贮藏淀粉[6]，暂时性贮藏淀粉能够被降解用于叶片自身或其他库组织的生长与新陈代谢[7]。淀粉粒位于叶绿体基质中，与质体小球等贮藏物质伴随叶绿体的生长发育逐步形成，淀粉粒内含有支链淀粉和直链淀粉，其中半结晶体状的支链淀粉占比较大。叶绿体中淀粉的代谢积累由许多酶协同调控，在叶绿体中蔗糖经转化酶（invertase，INV）[8]、己糖激酶（hexokinase，HXK）[9]、果糖激酶（fructokinase，FRK）[10]、磷酸葡萄糖变位酶（PGM）[11]等酶催化后形成葡萄糖-1-磷酸（glucose-1-phosphate，G-1-P），后经过腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）催化形成腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）和焦磷酸（pyrophosphoric acid，PPI），为淀粉的合成提供底物[12]，再经过颗粒淀粉合成酶（granule-bound starch synthase，GBSS）[13]，可溶性淀粉合成酶（SSS）[14]，淀粉分支酶（SBE）[15]的作用合成直链淀粉和支链淀粉，最后经淀粉去分支酶（starch debranching enzyme，DBE）[15]，淀粉水解酶（AMY、BAM）等催化酶将淀粉分解为各类单糖和二糖[16]，淀粉水解后其代谢产物被输送到胞质进行下一步代谢。葡萄未成熟的叶片中没有检测到淀粉，根系的表皮与须根内有极高的淀粉储备，地上部茎的中段检测到淀粉储备，这可能与茎中部所处位置有关，即营养向上供应给生长点，向下供给茎与根部[17]。陶然[6]在葡萄果皮和果肉的叶绿体中观察到了暂时性贮藏淀粉，幼果自身依靠光合作用积累淀粉，在夜间大量降解用于其他代谢，淀粉代谢的酶活性变化及相关基因的表达模式分析表明、、和在葡萄果实发育期淀粉代谢中发挥重要作用。Zhang等[18]基于转录组和代谢组分析光质对葡萄果实成熟的研究发现是葡萄果实淀粉代谢过程中的关键基因。还有研究通过对异源过表达的番茄进行转录组分析发现可通过调节淀粉水解提高番茄抗性[19]。【本研究切入点】在葡萄生产中，常通过各种架式控制树冠大小，进而实现葡萄树体高光合效率，而实现树体高光效目标的首要前提是光合产物合成的“工厂”——叶绿体功能的高效发挥。目前不同叶龄叶片光合作用与碳同化能力的研究多集中在园林植物[20-22]和禾本科农作物[23-24]上，有关葡萄叶龄的研究较少且多集中在不同叶龄叶片对环境胁迫的响应方面[25-27]，对不同叶龄叶片淀粉代谢积累的分子机制研究甚少。【拟解决的关键问题】利用高通量测序技术分析不同叶龄葡萄叶片中淀粉的代谢情况以及关键基因的差异表达，从分子水平上解释叶绿体中淀粉粒膨大、积累增多的调控机制，探讨影响叶片光合效率的机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020年6—8月在江苏省扬州市扬州大学扬子津校区果树试验基地内进行。于6月8日开始挂牌标记，每株顶端新梢处对第一节位的未展开叶片1片挂牌标记，共30片。观察周期为45 d。

植物材料选用2年生欧亚种‘黑比诺’（L. Pinot Noir）葡萄，试验地地处北纬33°33′62″，东经119°40′14″，属北亚热带湿润季风气候，年平均气温14.8℃，年平均日照2 172.3 h，年平均降雨量1 049.4 mm。葡萄树为无主干篱壁形，株行距为1.0 m×1.5 m，种植行为南北走向，挑选生长势较为一致且生长健壮的30株作为试材。

1.2 叶片生长动态观察

挑选生长势一致的10片挂牌叶进行生长动态观察。叶长与叶宽用电子数显游标卡尺测量。各生长阶段叶面积由Image J软件测量。

1.3 透射电镜观察

每个时期随机挑选6片叶，沿叶片中脉避开主脉切成5 mm×5 mm组织块，取样后立即投入2.5%戊二醛固定液中，放入冰盒，避光带回实验室抽气封口。在戊二醛固定液中4℃固定24 h后，送样至杭州浩克生物公司制片，返样后在Tecnai 12透射电镜TEM（Philips，荷兰）下观察拍照。

1.4 转录组测序及分析

选用未展开叶片NL，生长中叶片GL，成熟叶ML进行RNA文库构建和RNA测序（由北京诺和致源科技股份有限公司完成），每个样品设置3个生物学重复，总计9个样品。每个样品选择长势一致、健康的叶片10片，于晴天上午9：00—10：00间取样。使用SpectrumTMPlant Total RNA试剂盒（Sigma-Aldrich，美国）提取各样品总RNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳和Bioanalyzer 2100 System分析仪（Agilent Technologies，美国）检测RNA的完整性，使用NanoPhotometer® spectrophotometer（IMPLEN，美国）检测RNA纯度并用Qubit RNA Assay Kit试剂盒（Life Technologies，美国）测定各样品RNA浓度。质量检测后将合格的RNA样品进行文库构建和测序。

RNA测序使用Illumina Hiseq 4000平台（San Diego，美国），paired-end长度为150 bp。通过分析碱基组成和质量值分布控制原始数据质量，保证T碱基和A碱基的比例近等，大多数碱基的质量值都大于20。质控获得的原始数据过滤掉包含序列adapter，未知碱基比例大于10%的序列以及包含大量低质量碱基的序列（质量值Q≤10的碱基数占整条read的50%以上）后得到clean reads，clean reads通过TopHat v2.0.6软件比对到葡萄参考基因组[28]。使用HTSeq- count软件分析各样品基因表达水平，将数据标准化为FPKM值（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads），以确定每个基因的表达水平。使用DEGseq R package（1.20.0）分析样品中差异表达基因。筛选显著差异表达基因的标准为：校正后的-value（adj）＜0.05，|log2(fold change)|≥1。利用GO数据库和KEGG数据库对差异基因进行富集分析，差异基因显著富集的标准为：adj≤0.05。

1.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析

根据转录组测序分析结果，对筛选到的15个与淀粉合成代谢相关的差异基因进行RT-qPCR分析，以为内参基因。用Primer 5软件设计RT-qPCR引物（表1），交由上海生工生物公司合成引物。使用上海浦迪生物公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA，使用南京诺唯赞生物公司的反转录试剂盒R323-01将RNA反转录为cDNA，使用南京诺唯赞生物公司荧光定量试剂盒Q311-02说明书进行荧光定量扩增，荧光定量体系为20 μL。PCR反应在Bio-Rad CFX96（Bio-Rad，美国）荧光定量仪器上完成，程序为30 s，95℃预变性，10 s，95℃和30 s，60℃进行40次循环。荧光定量结果通过相对定量法（2-ΔΔCT）[29]进行分析，每个基因在每个时期各进行3次独立生物学重复。

1.6 数据分析

用Image J软件测量各样品长度与面积数据，PS 2020软件处理图片，Excel软件对所有测量的数据进行统计分析，SPSS 23进行数据相关性与显著性分析，不同的小写字母标记差异显著水平。

表1 ‘黑比诺’葡萄不同叶龄叶片RT-qPCR引物序列

2 结果

2.1 叶片生长动态观察

叶片主脉长度（叶长）和叶片最大横径（叶宽）在叶片刚展开时生长速度较慢，展开4 d后进入快速生长阶段，展开12 d后生长速度放缓。其中叶长增长量大于叶宽增长量。‘黑比诺’葡萄叶片生长呈单“S”形，叶片从未展开嫩叶生长至成熟功能叶需30 d左右，生长阶段分为快速生长期和缓慢生长期，总体趋势为“慢-快-慢”。展叶4 d内为第一次缓慢生长期，展叶4—12 d为快速生长期，展叶12 d后为第二次缓慢生长期（图1）。叶面积增长趋势与叶长、叶宽生长趋势相似，叶片刚开始生长时叶面积较小，进入快速生长期后叶面积迅速增大直至成熟（图2）。由叶面积变化情况划分试验取样时期，分为叶片第一次缓慢生长期内的未展开叶片(NL)、叶片快速生长期内的生长中叶片(GL)、以及第二次缓慢生长期内的成熟叶(ML)。

图1 黑比诺葡萄叶片生长动态

NL：未展开叶片；GL：生长中叶片；ML：成熟叶。下同

2.2 叶片细胞超微结构观察

图3显示，NL的叶绿体呈长椭球形，处于发育早期，长轴与细胞壁平行，贴近细胞内壁。叶绿体中淀粉粒还未完全发育，体积较小，积累少，形状不规则，大部分淀粉粒分散在叶绿体被膜周围，少数淀粉粒分布在基粒片层中。基粒类囊体垛叠层数多，排列整齐而致密，大多数基粒片层与叶绿体长轴平行，纹理清晰，与基质类囊体形成连续的内膜系统。叶绿体周围分布有圆形或椭圆形的线粒体。GL的叶绿体结构已形成，体积变大，其中淀粉粒体积变大，积累增加，形状为近椭圆形。基粒片层略分散，总体仍为纵向排列。ML的叶绿体紧贴细胞壁，积累增多，淀粉体体积明显增大。

1：未展开幼叶NL叶绿体（0.5 μm）；2：生长中叶片GL叶绿体（1 μm）；3：成熟叶片ML叶绿体（2 μm）。CH：叶绿体；S：淀粉体；M：线粒体；W：细胞壁；G：基粒

2.3 蔗糖淀粉代谢相关基因的筛选

2.3.1 转录组比较分析不同叶龄叶片差异表达基因 本研究以‘黑比诺’葡萄叶片3个不同叶龄即NL、GL、ML为样本进行高通量转录组测序，原始数据经过质控和GC含量分析，获得共计58.57 GB的clean data。3个时期的clean reads均在3 905万条以上，GC含量均在44.57%以上，其中GL样品各指标相对较高。各时期Q30均值为94.4%，表明测序质量较好，适用于后续分析。将clean reads与葡萄参考基因组比对（表2），平均有91.87%的clean reads比对到参考基因组上，其中89.4%—90.16%的reads比对到参考基因组的唯一位置。差异表达基因统计表明（图4），3个对比组合中DEGs总计10 856个，下调DEGs总计6 421个，上调DEGs总计5 614个，GLvsNL中特有的DEGs最少，数量仅为473个，MLvsNL中特有的DEGs数量最多，达1 560个。其中3个对比组合共有的DEGs有2 280个，共有的下调DEGs有969个，共有的上调DEGs有709个。GL与NL相比，有5 379个DEGs，其中上调DEGs为2 860个，下调DEGs为2 519个；ML与GL相比，有6 774个DEGs，其中有2 515个DEGs上调表达，4 259个DEGs下调表达；ML与NL相比，有9 188个基因差异表达，4 080个DEGs表达上调，5 108个DEGs表达下调。综上，随着叶片生长发育，叶肉细胞内基因表达情况变化较大，差异表达基因的数量逐渐增多。

表2 转录组数据与参考基因组比对结果

A、B、C：维恩图表示差异表达基因数目；D、E、F：柱状图表示差异表达基因数目 Venn (A, B, C) and Bar plot (D, E, F) illustrate the number of the DEGs

2.3.2 差异基因功能富集分析 对‘黑比诺’葡萄3个不同时期叶片的差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。3个时期的GO富集分析中，生物过程（biological process，BP）集中在细胞周期过程、光合作用、多糖代谢等方面，细胞组分（cellular component，CC）集中在类囊体合成、叶绿体合成、胞间连丝等方面，分子功能（molecular function，MF）主要为DNA解旋酶活动、叶绿素结合蛋白、UDP-糖基转移酶活性等方面（附表1）。KEGG富集结果显示，与NL相比，GL中差异表达的基因共涉及116个途径，富集最显著的是光合作用、光合作用-天线蛋白、DNA复制、错配修复和同源重组等13个代谢途径。与GL相比，ML中差异表达的基因共涉及119个途径，富集最显著的途径为类固醇生物合成、氨基糖和核苷酸糖的代谢、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢途径。与NL相比，ML中差异表达基因涉及120个途径，富集最显著的是淀粉和蔗糖代谢、光合作用-天线蛋白、光合作用、甘氨酸、碳代谢、DNA复制、植物激素信号转导等13个代谢途径。KEGG富集结果表明，3个时期的差异基因都有富集到植物激素信号转导途径、淀粉蔗糖代谢、光合作用途径，说明这些途径在叶片生长过程中发挥重要作用。其中GL和ML的差异基因在淀粉蔗糖代谢途径中显著富集（图5）。

X轴为途径名称，Y轴为每个途径富集的-log10（Padj） X-axis represents the pathway name; Y-axis represents the -log10 (Padj) enriched for each pathway

2.3.3 蔗糖与淀粉代谢通路差异基因分析 差异表达基因KEGG功能富集结果发现，与NL相比，在GL和ML中差异表达的基因都显著富集至蔗糖与淀粉代谢通路，而叶片超微结构观察显示淀粉随叶龄增长而积累，继而深入分析蔗糖与淀粉代谢通路相关基因，挖掘到15个关键差异表达基因。和在3个时期都为上调趋势，在GL和ML中上调明显，在ML中上调明显。催化形成ADPG的与催化合成淀粉的在3个时期都显示上调，其中在ML中上调增幅较大，在GL和ML中显著上调。在淀粉分解过程中，（）、（）以及（）在3个时期都显著上调，（）和（）在ML时期上调幅度较大（表3）。

表3 ‘黑比诺’葡萄不同叶龄叶片蔗糖与淀粉代谢相关差异表达基因分析

Log2FC为Log2（fold change） Log2FC is Log2 (fold change)

2.3.4 差异表达基因的RT-qPCR验证 利用RT-qPCR对蔗糖和淀粉代谢通路中筛选到的15个差异表达基因进一步验证，结果表明，、、、、、、、、、逐渐上调表达，逐渐下调表达，、在GL中高表达。蔗糖磷酸化相关基因、、、在成熟叶中表达量较低，淀粉合成相关基因、、、表达量逐渐上调，淀粉降解相关基因、、、表达量逐渐上调。其中有13个基因RT- qPCR结果与转录组测序结果在0.05水平下相关性显著，基因的表达趋势基本一致，比例达到86.7%，说明本研究转录组测序所得FPKM值相对准确（图6）。

3 讨论

3.1 葡萄叶片叶绿体内淀粉随叶龄的增加而积累

叶片是进行光合作用的重要场所，其产生的同化碳以蔗糖的形式通过韧皮部运输到各个“库”组织中，为库器官提供生长发育所需的碳水化合物与能量[30]。本研究通过透射电镜观察叶片超微结构发现，未展开叶的叶绿体体积较小，内部结构清晰，随着叶片叶龄增长，淀粉粒体积明显增大，积累增加，淀粉体分布的位置也从边缘扩展到中央，与前人在芦荟叶片生长过程中观察到的结果一致[31]。淀粉代谢酶的活性变化是引起葡萄果实和叶片中淀粉含量变化的直接原因，但导致其变化的调控机理相对复杂[32-33]。本研究中从未展开幼叶到成熟叶，葡萄叶片叶绿体内淀粉积累趋势为前期低、中期高，符合单峰曲线变化趋势，以往的研究发现夏季高温会导致葡萄叶片淀粉积累增加，这主要与高温下叶片韧皮部产生的胼胝质堵塞维管束，阻碍光合产物运输，从而导致淀粉粒在叶绿体内积累[34-36]。本研究中选取的成熟叶片虽然正值夏季高温季节，但是叶绿体内淀粉粒的增加是否与高温有关还需进一步研究。

代表Pearson相关系数；*表示在0.05水平下相关性显著；**表示在0.01水平下相关性显著

* represents significant correlation at the level of 0.05; ** represents significant correlation at the level of 0.01

图6 RT-qPCR验证RNA-seq鉴定的差异表达基因

Fig. 6 RT-qPCR verification of the DEGs identified in RNA-seq

3.2 蔗糖代谢相关基因可能通过调控淀粉合成底物生成影响不同叶龄叶片中淀粉的积累

叶片中光合产物由蔗糖转化为淀粉的过程中有多种酶参与。PGM属于己糖变位酶家族的磷酸葡萄糖变位酶，能催化糖代谢中间产物G-1-P（葡萄糖-1-磷酸）和G-6-P（葡萄糖-6-磷酸）相互转化，并使两者处于动态平衡，催化后G-1-P成为淀粉合成中间产物[37-39]。拟南芥完全失活后，其叶片鲜重下降，各组织生长受到影响[40]。香蕉在果实中高表达，且与果糖、葡萄糖、可溶性总糖含量呈显著正相关[41]。AGPase（腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶，EC2.7.7.27）催化G-1-P和ATP形成腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）和焦磷酸（PPi），并且提供GBSS和SSs合成淀粉的底物ADP[42]。拟南芥中突变体会导致AGPase酶活性丧失，最终导致淀粉合成减少[43]。有研究发现在玉米叶片中AGPase大亚基或小亚基缺失后，叶片中的淀粉全部被分解，不产生新淀粉[44]。葡萄不同叶龄中贮藏多糖淀粉积累的机制在分子层面研究较少，本研究通过对不同叶龄葡萄叶片进行转录组测序分析发现，与蔗糖和淀粉合成代谢相关的基因显著差异表达，推测这些差异基因可能与叶片叶绿体淀粉积累有关，和随着叶龄的增加而上调表达，这些基因在ML中高丰度的转录水平可能有利于ADPG的合成，为淀粉的积累提供了充足的底物。

3.3 淀粉合成和代谢相关基因是参与调控不同叶龄叶片中淀粉积累的关键因子

叶片中的暂时性贮藏淀粉主要以半结晶淀粉颗粒的形式储存，GBSS家族和SS家族各自催化形成的直链淀粉和支链淀粉共同构成了淀粉粒，而直链淀粉无定性结构，不是淀粉颗粒形成的必须条件，支链淀粉呈半结晶状，为淀粉颗粒提供基本结构[45]。拟南芥突变体经过光照处理后叶片淀粉水平下降23%[46]，而且拟南芥单突变、单突变以及双突变体还会引起淀粉结构的改变[47]。本研究中淀粉粒在未展开叶中体积较小，叶片开始生长后淀粉粒明显增大，成熟叶淀粉粒体积占比极大，与此同时，随着叶龄增加明显上调表达。表明在支链淀粉正常合成过程中具有重要作用，叶龄增长的同时，表达增强，利用ADPG底物合成支链淀粉的能力越强，充足的半结晶状支链淀粉是淀粉颗粒膨大的关键。SBE将-1,4葡聚糖直链供体（直链淀粉或支链淀粉的直链区）切开，随后将剪切后断链的还原末端连接到C6羟基上，催化葡聚糖链内-1,6糖苷键的形成，从而产生支链淀粉的分支结构，以此来促进淀粉的合成[48]。前人研究发现，会改变淀粉粒和支链淀粉的分子结构，SBE酶活性降低会导致淀粉合成速率降低[49-51]。本研究中，随着叶龄增加和表达水平显著增加，表明叶龄增大的同时，SBE酶对-1,4-葡聚糖直链的切割和重连活跃，促进了直链淀粉和支链淀粉的合成。AMY和BMY在植物生长发育与贮藏阶段淀粉降解为还原糖的过程中发挥重要作用。拟南芥上已鉴定到3个（），其中突变体虽然缺少了AMY活性，但拟南芥叶片中淀粉分解过程没有受到影响，表明可能不参与叶片中淀粉的降解[52]。本研究中和在3个时期都上调表达，没有差异表达，推测与在淀粉水解过程中没有发挥作用有关。果树上已有研究表明BAM水解淀粉产生的麦芽糖是逆境胁迫中重要的渗透调节物质之一，苹果定位于叶绿体，在苹果遭遇低温胁迫时能被低温快速诱导且上调表达，参与调控苹果抗寒性[53]。枳能快速响应低温胁迫调控植物抗寒性[54]。本研究中发现2个（和）随葡萄叶龄增长而上调表达，尤其在不同叶龄叶片中均显著差异表达，这可能与成熟叶片中暂时贮藏性淀粉的代谢有关。葡萄叶片淀粉合成机制较为复杂，其水解过程也同样复杂，有多种酶参与，水解产物不仅有葡萄糖、麦芽糖、糊精，还有海藻糖等物质，其中葡萄糖和麦芽糖被输出叶绿体，在胞质中进行下一步代谢[55]，但其代谢途径和相关调控基因在葡萄不同叶龄叶片中有待进一步研究。

4 结论

‘黑比诺’葡萄未展开叶片叶绿体体积较小，内部结构清晰，淀粉粒体积小，淀粉积累少，随着叶龄增长，叶绿体和淀粉粒体积增大，其中淀粉粒体积在叶绿体体积中占比较大，淀粉积累增多。生长中叶和成熟叶中差异表达的基因在淀粉与蔗糖代谢通路上显著富集，同时对淀粉蔗糖代谢通路中关键差异基因进行RT-qPCR验证发现，淀粉的积累由、等基因调控，而和则参与淀粉的水解，推测上述淀粉蔗糖代谢相关基因通过不同的表达模式共同调控叶片中碳流的转化与积累。

[1] 张芮, 成自勇, 王旺田, 吴玉霞, 牛黎莉, 张晓霞, 高阳, 陈娜娜, 马奇梅. 不同生育期水分胁迫对延后栽培葡萄产量与品质的影响. 农业工程学报, 2014, 30(24): 105-113.

ZHANG R, CHENG Z Y, WANG W T, WU Y X, NIU L L, ZHANG X X, GAO Y, CHEN N N, MA Q M. Effect of water stress in different growth stages on grape yield and fruit quality under delayed cultivation facility. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2014, 30(24): 105-113. (in Chinese)

[2] IACONO F, SOMMER K J. Response of electron transport rate of water stress-affected grapevines: Influence of leaf age. Vitis, 2000, 39(4): 137-144.

[3] CALUGR A, CORDEA M I, BABE A, FEJER M. Dynamics of starch reserves in some grapevine varieties (L.) during dormancy. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca Horticulture, 2019, 76(2): 185-192.

[4] HUNTER J J, RUFFNER H P, VOLSCHENK C G. Starch concentrations in grapevine leaves, berries and roots and the effect of canopy management. South African Journal for Enology & Viticulture, 1995, 16(2): 35-40.

[5] KIKUZAWA K, LECHOWICZ M J. Ecology of Leaf Longevity. Springer Tokyo2011: 23-35.

[6] 陶然. 葡萄果实发育阶段淀粉代谢分子机理与香气相关基因表达分析[D]. 南京: 南京农业大学, 2014.

TAO R. Study on starch metabolism and expression analysis of aroma gene during grape berry development [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2014. (in Chinese)

[7] ZEEMAN S C, KOSSMANN J, SMITH A M. Starch: Its metabolism, evolution, and biotechnological modification in plants. Annual Review of Plant Biology, 2010, 61: 209-234. doi: 10.1146/annurev- arplant-042809-112301.

[8] 李肖蕖, 王建设, 张根发. 植物蔗糖转化酶及其基因表达调控研究进展. 园艺学报, 2008, 35(9): 1384-1392.

LI X Q, WANG J S, ZHANG G F. Advanced in plant invertase and regulation of gene expression. Acta Horticulturae Sinica, 2008, 35(9): 1384-1392. (in Chinese)

[9] HAYES M A, DAVIES C, DRY I B. Isolation, functional characterization, and expression analysis of grapevine (L.) hexose transporters: Differential roles in sink and source tissues. Journal of Experimental Botany, 2007, 58(8): 1985-1997. doi: 10.1093/jxb/erm061.

[10] 崔娜, 王卫平, 林凤, 白丽萍, 张玉龙. 植物果糖激酶的研究进展. 中国农学通报, 2010, 26(14): 41-47.

CUI N, WANG W P, LIN F, BAI L P, ZHANG Y L. Update on fructokinase in higher plants. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2010, 26(14): 41-47. (in Chinese)

[11] 李晓屿, 李玉花, 李晗, 李治龙, 蓝兴国. 植物葡萄糖磷酸变位酶的研究进展. 植物生理学报, 2015, 51(5): 617-622.

LI X Y, LI Y H, LI H, LI Z L, LAN X G. Advances in research on phosphoglucomutase in plants. Plant Physiology Journal, 2015, 51(5): 617-622. (in Chinese)

[12] BALLICORA M A, IGLESIAS A A, PREISS J. ADP-glucose pyrophosphorylase: A regulatory enzyme for plant starch synthesis. Photosynthesis Research, 2004, 79(1): 1-24. doi: 10.1023/b: pres. 0000011916.67519.58.

[13] 苗红霞, 孙佩光, 张凯星, 金志强, 徐碧玉. 植物颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)基因的表达调控机制研究进展. 生物技术通报, 2016, 32(3): 18-23.

MIAO H X, SUN P G, ZHANG K X, JIN Z Q, XU B Y. Research progress on expression regulation mechanism of genes encoding granule-bound starch synthase in plants. Biotechnology Bulletin, 2016, 32(3): 18-23. (in Chinese)

[14] 张军杰, 黄玉碧. 玉米可溶性淀粉合成酶研究进展. 玉米科学, 2006, 14(6): 151-154.

ZHANG J J, HUANG Y B. Resrarch progress in maize (L.) soluble starch synthase. Journal of Maize Sciences, 2006, 14(6): 151-154. (in Chinese)

[15] 姚新灵, 丁向真, 陈彦云, 吴晓玲, 郭蔼光. 淀粉分支酶和去分支酶编码基因的功能. 植物生理学通讯, 2005, 41(2): 253-259.

YAO X L, DING X Z, CHEN Y Y, WU X L, GUO A G. Functions of genes encoding starch branch enzyme and debranch enzyme. Plant Physiology Communications, 2005, 41(2): 253-259. (in Chinese)

[16] ZHAO L Y, GONG X, GAO J Z, DONG H Z, ZHANG S L, TAO S T, HUANG X S. Transcriptomic and evolutionary analyses of white pear ()-amylase genes reveals their importance for cold and drought stress responses. Gene, 2019, 689: 102-113. doi: 10.1016/j.gene.2018.11.092.

[17] WINKLER A J, WILLIAMS W O. Starch and sugars of. Plant Physiology, 1945, 20(3): 412-432. doi: 10.1104/pp.20.3.412.

[18] ZHANG P A, LU S W, LIU Z J, ZHENG T, DONG T Y, JIN H C, JIA H F, FANG J G. Transcriptomic and metabolomic profiling reveals the effect of LED light quality on fruit ripening and anthocyanin accumulation in cabernet sauvignon grape. Frontiers in Nutrition, 2021, 8: 790697. doi: 10.3389/fnut.2021.790697.

[19] LIANG G P, HE H H, NAI G J, FENG L D, LI Y M, ZHOU Q, MA Z H, YUE Y, CHEN B H, MAO J. Genome-wide identification of BAM genes in grapevine (L.) and ectopic expression ofmodulating soluble sugar levels to improve low-temperature tolerance in tomato. BMC Plant Biology, 2021, 21: 156-171.

[20] 贺安娜, 谭晓利. 虎耳草不同叶龄光合特性及叶片结构比较. 中国农学通报, 2011, 27(16): 122-125.

HE A N, TAN X L. Comparative analysis of different leaf age of saxifrage based on photosynthetic characters and leaf structure. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2011, 27(16): 122-125. (in Chinese)

[21] 周会萍, 王晓冰, 徐鑫, 周晓君. 红叶石楠不同叶龄叶片的光合特性研究. 西部林业科学, 2020, 49(1): 39-45.

ZHOU H P, WANG X B, XU X, ZHOU X J. Photosynthetic characteristics offraseri leaves at different ages. Journal of West China Forestry Science, 2020, 49(1): 39-45. (in Chinese)

[22] 理挪, 王培, PEGGY C A E, 林思祖, 陈宇. 不同叶龄杉木叶片形态及光合特性分析. 亚热带农业研究, 2018, 14(3): 167-171.

LI N, WANG P, PEGGY C A E, LIN S Z, CHEN Y. Leaf morphology and photosynthetic characteristics at different leaf ages in Chinese fir. Subtropical Agriculture Research, 2018, 14(3): 167-171. (in Chinese)

[23] 吴桂成, 张洪程, 吴文革, 王艳, 戴其根, 霍中洋, 许轲, 魏海燕. 不同叶龄期追施穗肥对粳型超级稻产量及品质的影响. 安徽农业科学, 2010, 38(18): 9440-9441, 9528.

WU G C, ZHANG H C, WU W G, WANG Y, DAI Q G, HUO Z Y, XU K, WEI H Y. Effects of dressing ear fertilizer in different leaf age on the yield and quality ofsuper rice. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2010, 38(18): 9440-9441, 9528. (in Chinese)

[24] 刘慧迪, 杨克军, 李佐同, 王玉凤, 张翼飞, 王智慧, 付健, 谷英楠, 杨系玲, 吴琼. 松嫩平原西部膜下滴灌玉米基于叶龄指数的适宜追氮量研究. 植物营养与肥料学报, 2016, 22(3): 811-820.

LIU H D, YANG K J, LI Z T, WANG Y F, ZHANG Y F, WANG Z H, FU J, GU Y N, YANG X L, WU Q. Suitable amount of N topdressing based on leaf age index of maize using mulched drip irrigation technology in Western Songnen Plain. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer, 2016, 22(3): 811-820. (in Chinese)

[25] 史晓敏, 刘竞择, 张艳霞, 陈祖民, 郭帅奇, 王振平. 水分胁迫对‘赤霞珠’不同叶龄叶片光合特性的影响. 果树学报, 2021, 38(1): 50-63.

SHI X M, LIU J Z, ZHANG Y X, CHEN Z M, GUO S Q, WANG Z P. Effects of water stress on photosynthetic characteristics of ‘Cabernet Sauvignon’ at different leaf ages. Journal of Fruit Science, 2021, 38(1): 50-63. (in Chinese)

[26] 郭帅奇, 刘竞择, 张艳霞, 陈祖民, 史晓敏, 王振平. 水分胁迫对‘赤霞珠’葡萄不同叶龄叶片糖含量及相关代谢酶活性的影响. 北方园艺, 2021(12): 17-26.

GUO S Q, LIU J Z, ZHANG Y X, CHEN Z M, SHI X M, WANG Z P. Effects of water stress on sugar content and related metabolic enzyme activities in leaves of ‘Cabernet Sauvignon’ grape at different leaf ages. Northern Horticulture, 2021(12): 17-26. (in Chinese)

[27] 李予霞, 崔百明, 董新平, 王雪莲. 水分胁迫下葡萄叶片脯氨酸和可溶性总糖积累与叶龄的关系. 果树学报, 2004, 21(2): 170-172.

LI Y X, CUI B M, DONG X P, WANG X L. Relationship between accumulation of proline and soluble sugar with age of grape leaves in water stress. Journal of Fruit Science, 2004, 21(2): 170-172. (in Chinese)

[28] JAILLON O, AURY J M, NOEL B, POLICRITI A, CLEPET C, CASAGRANDE A, CHOISNE N, AUBOURG S, VITULO N, JUBIN C, VEZZI A, LEGEAI F, HUGUENEY P, DASILVA C, HORNER D, MICA E, JUBLOT D, POULAIN J, BRUYÈRE C, BILLAULT A,. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature, 2007, 449(7161): 463-467. doi: 10.1038/nature06148.

[29] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod. Methods, 2001, 25(4): 402-408. doi: 10.1006/meth.2001.1262.

[30] 张懿, 张大兵, 刘曼. 植物体内糖分子的长距离运输及其分子机制. 植物学报, 2015, 50(1): 107-121. doi: 10.3724/SP.J.1259.2015.00107.

ZHANG Y, ZHANG D B, LIU M. The molecular mechanism of long-distance sugar transport in plants. Chinese Bulletin of Botany, 2015, 50(1): 107-121. doi: 10.3724/SP.J.1259.2015.00107. (in Chinese)

[31] 李金亭, 胡正海, 高鹏. 木立芦荟不同叶龄叶的解剖学和组织化学及其植物化学研究. 西北植物学报, 2007, 27(11): 2202-2209.

LI J T, HU Z H, GAO P. Anatomy, histochemistry and phytochemistry ofleaves according to leaf-age. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2007, 27(11): 2202-2209. (in Chinese)

[32] 张娟, 王玉安. 施氮量对‘马瑟兰’葡萄叶片糖代谢的影响. 甘肃农业大学学报, 2020, 55(6): 97-103.

ZHANG J, WANG Y A. Effects of nitrogen application on glucose metabolism in ‘Maseran’ grape leaves. Journal of Gansu Agricultural University, 2020, 55(6): 97-103. (in Chinese)

[33] 李鹏程, 李铭, 郁松林, 郭绍杰, 苏学德. GA3对葡萄果实淀粉积累及代谢相关酶活性的影响. 北方园艺, 2011(11): 17-22.

LI P C, LI M, YU S L, GUO S J, SU X D. Effects of GA3on the amylopectin accumulation and related enzyme activities in amylopectin metabolism of grape fruits. Northern Horticulture, 2011(11): 17-22. (in Chinese)

[34] 刘敏, 房玉林. 高温胁迫对葡萄幼树生理指标和超显微结构的影响. 中国农业科学, 2020, 53(7): 1444-1458.

LIU M, FANG Y L. Effects of heat stress on physiological indexes and ultrastructure of grapevines. Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(7): 1444-1458. (in Chinese)

[35] 张洁, 李天来. 日光温室亚高温对番茄光合作用及叶绿体超微结构的影响. 园艺学报, 2005, 32(4): 614-619.

ZHANG J, LI T L. Effects of daytime sub-high temperature on photosynthesis and chloroplast ultrastructure of tomato leaves in greenhouse. Acta Horticulturae Sinica, 2005, 32(4): 614-619. (in Chinese)

[36] 马晓丽, 刘雪峰, 杨梅, 颜秋杨, 袁项成, 向苹苇. 镁肥对葡萄叶片糖、淀粉和蛋白质及果实品质的影响. 中国土壤与肥料, 2018(4): 114-120.

MA X L, LIU X F, YANG M, YAN Q Y, YUAN X C, XIANG P W. Effects of magnesium application on the leaves sugar, starch and protein content and the fruit quality of grapes. Soil and Fertilizer Sciences in China, 2018(4): 114-120. (in Chinese)

[37] ZIMMERMANN P, HIRSCH-HOFFMANN M, HENNIG L, GRUISSEM W. GENEVESTIGATOR.microarray database and analysis toolbox. Plant Physiology, 2004, 136(1): 2621-2632. doi: 10.1104/pp.104.046367.

[38] KEURENTJES J J, SULPICE R, GIBON Y, STEINHAUSER M C, FU J, KOORNNEEF M, STITT M, VREUGDENHIL D. Integrative analyses of genetic variation in enzyme activities of primary carbohydrate metabolism reveal distinct modes of regulation in. Plant Signaling & Behavior, 2008, 9(8): R129. doi: 10.1186/gb-2008-9-8-r129.

[39] LAFTA A M, FUGATE K K. Metabolic profile of wound-induced changes in primary carbon metabolism in sugarbeet root. Phytochemistry, 2011, 72(6): 476-489. doi: 10.1016/j.phytochem.2010.12.016.

[40] MALINOVA I, KUNZ H H, ALSEEKH S, HERBST K, FERNIE A R, GIERTH M, FETTKE J, KUSANO M. Reduction of the cytosolic phosphoglucomutase inreveals impact on plant growth, seed and root development, and carbohydrate partitioning. PLoS ONE, 2014, 9(11): e112468.

[41] 林雪茜, 彭淼, 吴少平, 易干军, 董涛, 钟晓红, 高慧君. ‘中蕉9号’与‘巴西蕉’果实后熟过程中可溶性糖积累差异的原因分析. 果树学报, 2019, 36(11): 1524-1539.

LIN X X, PENG M, WU S P, YI G J, DONG T, ZHONG X H, GAO H J. A comparative analysis of the differences in starch degradation and soluble sugar accumulation between ‘Zhongjiao No. 9’ and ‘Baxijiao’ during fruit ripening. Journal of Fruit Science, 2019, 36(11): 1524-1539. (in Chinese)

[42] 余春梅, 陈佩度, 季本华. 小麦胚乳淀粉合成酶基因研究进展. 麦类作物学报, 2004, 24(4): 123-128.

YU C M, CHEN P D, JI B H. Advances on the genes of starch synthesis enzymes in wheat endosperm. Acta Tritical Crops, 2004, 24(4): 123-128. (in Chinese)

[43] VENTRIGLIA T, KUHN M L, RUIZ M T, RIBEIRO-PEDRO M, VALVERDE F, BALLICORA M A, PREISS J, ROMERO J M. TwoADP-Glucose pyrophosphorylase large subunits (APL1 and APL2) are catalytic. Plant Physiology, 2008, 148(1): 65-76.

[44] BOEHLEIN S K, SHAW J R, BOEHLEIN T J, BOEHLEIN E C, HANNAH L C. Fundamental differences in starch synthesis in the maize leaf, embryo, ovary and endosperm. The Plant Journal, 2018, 96(3): 595-606. doi: 10.1111/tpj.14053.

[45] BULÉON A, COLONNA P, PLANCHOT V, BALL S. Starch granules: Structure and biosynthesis. International Journal of Biological Macromolecules, 1998, 23(2): 85-112.

[46] DELVALLÉ D, DUMEZ S, WATTEBLED F, ROLDÁN I, PLANCHOT V, BERBEZY P, COLONNA P, VYAS D, CHATTERJEE M, BALL S, MÉRIDA A, D'HULST C. Soluble starch synthase I: A major determinant for the synthesis of amylopectin inleaves. The Plant Journal, 2005, 43(3): 398-412. doi: 10.1111/j.1365- 313x.2005.02462.x.

[47] SZYDLOWSKI N, RAGEL P, HENNEN-BIERWAGEN T A, PLANCHOT V, MYERS A M, MÉRIDA A, D'HULST C, WATTEBLED F. Integrated functions among multiple starch synthases determine both amylopectin chain length and branch linkage location inleaf starch. Journal of Experimental Botany, 2011, 62(13): 4547-4559. doi: 10.1093/jxb/err172.

[48] 陈雅玲, 包劲松. 水稻胚乳淀粉合成相关酶的结构、功能及其互作研究进展. 中国水稻科学, 2017, 31(1): 1-12.

CHEN Y L, BAO J S. Progress in structures, functions and interactions of starch synthesis related enzymes in rice endosperm. Chinese Journal of Rice Science, 2017, 31(1): 1-12. (in Chinese)

[49] NISHI A, NAKAMURA Y, TANAKA N, SATOH H. Biochemical and genetic analysis of the effects ofmutation in rice endosperm.Plant Physiology, 2001, 127(2): 459-472.

[50] KASEMSUWAN T, JANE J L, SCHNABLE P, ROBERTSON D. Characterization of the dominant mutant amylose-extender (Ae1-5180) maize starch. Cereal Chemistry, 1995, 72(5): 457-464.

[51] SMITH A M, NEUHAUS H E, STITT M. The impact of decreased activity of starch-branching enzyme on photosynthetic starch synthesis in leaves of wrinkled-seeded peas. Planta, 1990, 181(3): 310-315. doi: 10.1007/BF00195881.

[52] YU T S, ZEEMAN S C, THORNEYCROFT D, FULTON D C, DUNSTAN H, LUE W L, HEGEMANN B, TUNG S Y, UMEMOTO T, CHAPPLE A, TSAI D L, WANG S M, SMITH A M, CHEN J, SMITH S M. Alpha-Amylase is not required for breakdown of transitory starch inleaves. The Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(11): 9773-9779. doi: 10.1074/jbc.m413638200.

[53] 王海波, 王森, 何平, 常源升, 李林光, 何晓文. 苹果-淀粉酶基因的克隆和低温响应表达分析. 分子植物育种, 2020, 18(13): 4205-4212.

WANG H B, WANG S, HE P, CHANG Y S, LI L G, HE X W. Cloning and expression response to low-temperature stress of-amylase gene () in apple. Molecular Plant Breeding, 2020, 18(13): 4205-4212. (in Chinese)

[54] PENG T, ZHU X F, DUAN N, LIU J H. PtrBAM1, a-amylase- coding gene of, is a CBF regulon member with function in cold tolerance by modulating soluble sugar levels. Plant, Cell & Environment, 2014, 37(12): 2754-2767. doi: 10.1111/pce. 12384.

[55] 周凯悦. 大豆盐胁迫下叶绿体淀粉积累转录组及相关基因功能研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2020.

ZHOU K Y. Transcriptome analysis and research of related gene function of starch accumu lation in soybean chloroplast under salt stress [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2020. (in Chinese)

Analysis Reveals the Differential Expression of Genes Related to Starch Accumulation in Chloroplast of Leaf with Different Ages in Pinot Noir Grape

YOU JiaLing, LI YouMei, SUN MengHao, XIE ZhaoSen

College of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu

【Objective】The accumulation of starch in chloroplast of grape leaves increased with leaf maturation, but the related molecular mechanism has not been reported. In this study, the potential related genes were screened in order to clarify the molecular regulation mechanism of starch accumulation in chloroplast of grape leaves with different leaf ages.【Method】 Two years old ‘Pinot Noir’ grapes (L.) were used as plant materials to investigate the dynamic changes of starch accumulation in chloroplast of leaves with different ages. The RNA sequencing technology was used to characterize the differently expressed genes (DEGs) involved in starch and sucrose metabolism in leaves with different ages. The expression levels of several key candidate genes were detected by using real-time quantitative qPCR.【Result】The starch grains in NL (undeveloped leaves) were smallest in volume and lowest in number compared with these in GL (growing leaves) and ML (mature leaves). With the increase of leaf ages, the volume and amount of starch grains in GL and ML also increased. A total of 58.57 GB valid data was obtained by RNA-sequencing. Differentially expressed genes mainly involved in starch and sucrose metabolism pathway for the leaves with different ages. The genes involved in the process of sucrose conversion into starch synthesis precursor adenosine diphosphate glucose (ADP) showed up-regulated expression level with the increase of leaf ages, including cell wall invertase (), phosphoglucomutase (), and ADP-glucose pyrophosphorylase (). The genes involved in starch synthesis and hydrolysis also presented up-regulated expression level with the increase of leaf ages, including soluble starch synthase(), starch branching enzyme(), α-amylase (), and β-amylase ().,andplayed an important role in synthesis of amylopectin with semi-crystalline structure.【Conclusion】With the increase of leaf ages, the starch accumulation in chloroplast also increased.,andgenes could be the key genes involved in the regulation of starch accumulation in chloroplast of grape leaves.

Pinot Noirtranscriptome; leaf age; starch; starch metabolism

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.21.013

2022-02-21；

2022-04-20

国家自然科学基金（31872050）、国家自然科学基金青年基金（32102348）

尤佳玲，E-mail：youjialing1948@163.com。通信作者谢兆森，E-mail：xiezhaosen@yzu.edu.cn

（责任编辑 赵伶俐）