神经损伤标志物在儿童结核性脑膜炎中的动态变化特征及意义

石家云 王曼知 周海依 张小佛 危松青

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是一种常见的肺外结核，可导致儿童高病亡率和致残率，是肺外结核中病情最重、危害最大、破坏性最强的类型，严重威胁儿童生命健康[1]。近年来，TBM的发病率也明显增加，尤其在发展中国家，儿童结核病患者中TBM的发病率高达20%[2]。尽管规范和足量的化疗有助于控制病情，但至今TBM病亡率仍高达30%，且幸存者中约53.9%留有永久性神经系统后遗症[3]。早期诊断并尽早开始治疗对于TBM的治愈至关重要。然而，目前TBM早期精准诊断的分子标志物仍极为缺乏。

近年研究发现，神经组织标志物神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、S100B、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)在感染、创伤、中风、出血、神经退行性疾病等多种中枢神经系统疾病中可作为疾病诊断和预后的生物标志物，其血清及脑脊液浓度与患者脑损伤的程度及患者的不良预后呈明显正相关，且与疾病的病理改变一致[4-6]。在中枢神经系统感染性疾病的研究中，这些分子标志物目前主要应用于病毒性脑炎和化脓性脑膜炎，而其在TBM中的潜在应用价值尚缺乏循证医学证据。因此，笔者探讨NSE、S100B、GFAP在结核性脑膜炎患儿血清及脑脊液的变化及对患儿预后的影响，为临床早期诊断和评估TBM的脑损伤严重程度及预后提供新的量化指标。

对象和方法

一、研究对象遴选

1.研究对象：采用前瞻性研究方法，连续纳入2018年1月1日至2021年12月31日于南华大学附属长沙中心医院儿童结核科收治的72例TBM患儿作为TBM组。搜集同期住院，诊断为肺结核同时排除TBM的患儿20例作为肺结核组。对照组为入院时反复高热，伴或不伴头痛和呕吐，精神欠佳等疑似脑膜炎症状患儿。所有研究对象均进行血液、脑脊液、头颅CT扫描和MRI检查。本研究获得南华大学附属长沙中心医院医学伦理委员会的批准(2019-S0129)，获得所有研究对象父母或其他监护人的知情同意。

2.纳入标准：(1)TBM组：①符合TBM诊断标准[7]；②临床资料完整，依从性好；③经知情同意，并签署知情同意书。(2)肺结核组：①符合肺结核诊断[8]；②临床资料完整。

3.排除标准：(1)TBM组：①复治的TBM患者；②入院前已行抗结核治疗；③无法排除其他原因的中枢神经系统疾病；④耐药TBM。(2)肺结核组：①合并TBM患者；②入院前已行抗结核治疗。

二、资料收集

通过查阅病历资料，收集研究对象和对照组的临床信息，包括性别、年龄、治疗、预后；对照组入院后48 h内的血清及脑脊液NSE、S100B、GFAP浓度值；TBM组入院后48 h内及治疗后1、2、3周的血清及脑脊液NSE、S100B、GFAP浓度值。

三、治疗与预后

1.TBM组：参照世界卫生组织(World Health Organization，WHO)指南推荐[9]，采用标准抗结核治疗方案，即：2H-R-Z-E/10H-R(H：异烟肼，10～20 mg·kg-1·d-1， 最大剂量500 mg；R：利福平，10～20 mg·kg-1·d-1，最大剂量600 mg；Z：吡嗪酰胺，30～35 mg·kg-1·d-1，最大剂量 2000 mg；E：乙胺丁醇，15～20 mg·kg-1·d-1，最大剂量1000 mg；异烟肼、利福平、乙胺丁醇给药频率均为1次/d；吡嗪酰胺给药频率为2次/d)。同时，给予糖皮质激素辅助治疗(2 mg/kg，最大剂量60 mg，6～8周逐渐减停)。个别患儿因病情严重、合并感染、继发肝功能受损等，加用利奈唑胺或氟喹诺酮类药物。正规抗结核治疗6个月后，急性症状及体征减少或消失，处于疾病后遗症期，国内外学者常以6个月为时间节点研究及判断预后[10-11]。治疗6个月后，门诊或电话随访患儿，参照Thee等[11]的标准，分为完全康复组(无神经系统后遗症)和预后不良组(出现以下任一项：肢体瘫痪，痉挛，颅神经麻痹，癫痫，发育迟缓，慢性脑积水，视力、听力及语言障碍，植物人，死亡)。

2. 肺结核组：儿童涂片阴性药物敏感肺结核患者采用2H-R-Z/4H-R治疗方案，涂片阳性、肺广泛实变者采用2H-R-Z-E/4H-R治疗方案[12]，即强化期常规异烟肼(10 mg·kg-1·d-1，最大剂量300 mg，1次/d)、利福平(15 mg·kg-1·d-1，最大剂量600 mg，1次/d)、吡嗪酰胺(35 mg·kg-1·d-1，2次/d)和(或)乙胺丁醇(20 mg·kg-1·d-1，1次/d)，治疗2个月，巩固期采用异烟肼和利福平治疗4个月。

四、实验室检测

TBM组于入院48 h内及治疗后1、2、3周收集4 ml外周静脉血及2 ml脑脊液。肺结核组于入院48 h内收集4 ml外周静脉血及2 ml脑脊液。收集的血液标本置于乙二胺四乙酸二钠抗凝管中，4 ℃，3000 r/min(离心半径10 cm)，离心10 min，取上清液置于-80 ℃保存备用；脑脊液标本标记好置于-80 ℃保存备用。

采用酶联免疫吸附试验测定TBM组及肺结核组入院48 h内血清及脑脊液中NSE、S100B、GFAP的含量；测定TBM组治疗后1、2、3周NSE、S100B、GFAP的动态变化情况。酶标检测仪购自美国BioTeK公司(型号Epoch)；检测试剂均购自美国R&D公司，NSE、S100B、GFAP检测试剂货号分别为DY2062、DY1820、DY2594，批次分别为P184753、P186491、P185817。

五、统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行分析，偏态分布的计量资料用“中位数(四分位数)[M(Q1，Q3)]”描述，组间差异的比较采用秩和检验。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线及曲线下面积(area under the curve，AUC)分析TBM患儿入院时脑脊液NSE、S100B、GFAP水平，预测其不良预后的阈值、敏感度及特异度。

结 果

一、基本情况

TBM组72例，其中，男38例(52.8%)，女34例(47.2%)；年龄[M(Q1，Q3)]为59(1，168)月；年龄分组参照Rohlwink 等[13]标准：0～2岁35例(48.6%)，3～5岁7例(9.7%)，>5岁30例(41.7%)。肺结核组20例，其中，男12例(60.0%)，女8例(40.0%)；年龄[M(Q1，Q3)]为73(4，168)月； 0～2岁8例(40.0%)，3～5岁3例(15.0%)，>5岁9例(45.0%)。TBM组与肺结核组年龄及性别分布差异无统计学意义(Z值分别为-1.243和-0.860，P值分别为0.217和0.390)。

TBM组中47例(65.3%)完全康复，25例(34.7%)预后不良(肢体瘫痪6例，继发癫痫8例，慢性脑积水2例，动眼神经麻痹2例，语言障碍1例，死亡6例)。

二、神经组织标志物水平比较

1.治疗前情况比较：NSE、S100B、GFAP在TBM组及肺结核组入院时血清及脑脊液的表达比较显示，与肺结核组相比，TBM组血清及脑脊液的NSE、S100B、GFAP表达均明显升高，差异均有统计学意义(表1)。与完全康复组比较，预后不良组血清NSE、S100B、GFAP表达差异无统计学意义(Z值分别为-0.604、-0.728、-1.049，P值分别为0.513、0.467、0.071)；而脑脊液NSE、S100B、GFAP表达明显升高，差异均有统计学意义(Z值分别为-4.855、-3.212、-6.334，P值分别为0.000、0.001、0.000)。

表1 结核性脑膜炎患儿与肺结核患儿治疗前神经组织标志物水平的比较 [μg/L,M(Q1，Q3)]

2.治疗后动态变化情况：比较NSE、S100B、GFAP在完全康复组和预后不良组治疗后1、2、3周的动态变化。(1)经治疗后1周，完全康复组和预后不良组血清NSE、S100B、GFAP降至基本正常；治疗后1、2、3周NSE、S100B、GFAP组间差异无统计学意义。与完全康复组比较，预后不良组治疗后1、2、3周血清NSE、S100B、GFAP表达差异无统计学意义(表2)。(2)完全康复组与预后不良组脑脊液NSE、S100B、GFAP表达在治疗后1、2、3周比较，组间差异均有统计学意义。与完全康复组比较，预后不良组脑脊液NSE、S100B、GFAP在治疗后1、2、3周表达明显升高，差异均有统计学意义(表3)。

表2 血清中神经组织标志物水平在不同治疗预后结核性脑膜炎患儿中的比较 [μg/L，M(Q1，Q3)]

表3 脑脊液中神经组织标志物水平在不同治疗预后结核性脑膜炎患儿中的比较 [μg/L，M(Q1，Q3)]

三、神经组织标志物对TBM预后的预测价值

ROC曲线分析显示，TBM患儿入院时脑脊液NSE、S100B、GFAP预测TBM预后不良的AUC分别为0.753(95%CI：0.637～0.868，P<0.01)、0.879(95%CI：0.759～0.963，P<0.01)、0.803(95%CI：0.702～0.904，P<0.01)。依据ROC曲线，分别以其最大约登指数确定3种生物标志物的检测阈值，可知NSE水平为51.92 μg/L时，预测TBM预后不良的敏感度为76.24%、特异度为78.95%。S100B水平为2.75 μg/L时，预测TBM预后不良的敏感度为85.7%、特异度为96.5%。GFAP水平为77.54 μg/L时，预测TBM预后不良的敏感度为76.43%、特异度为70.97%(图1)。

图1 脑脊液神经组织标志物预测结核性脑膜炎患儿预后不良的受试者工作特征曲线

讨 论

尽管近年来儿童TBM诊治取得一定进展，但由于儿童TBM早期症状错综复杂，缺乏敏感度高、特异度好的精准分子生物学检测手段，早期诊断困难，病情易被延误，以致错失最佳治疗时机；虽经积极抗结核和抗炎治疗，但仍有较高病亡率或遗留神经系统后遗症[3]。因此，早期诊断、尽早进行临床干预、及时恰当评估预后是降低儿童TBM病亡率和致残率的关键。

近年来，越来越多的学者关注神经组织损伤标志物，它们可以反映神经细胞的损伤程度，将临床和影像学资料难以量化的损伤进行定量分析，能更早提示神经损伤。NSE是1965年首次被发现于脑组织中而不存在于非神经组织中的酸性可溶性蛋白，是中枢神经元损伤的敏感和特异标志[14]。S100B被认为是神经胶质细胞特异性蛋白，在哺乳动物分布具有特异性，主要分布于神经胶质细胞及施万细胞，也可反映中枢神经系统损伤的程度[15]。GFAP是中枢神经系统中独有的细胞骨架蛋白，是星形胶质细胞的主要成分。星形胶质细胞在脑的发育和正常功能中起到重要作用[16]。DeKosky等[17]研究发现，GFAP在新型冠状病毒肺炎患者脑损伤检测中有明确的预测价值。中枢神经系统损伤、创伤或炎症后，神经元、神经胶质细胞及星形胶质细胞损伤和死亡增多，NSE、S100B、GFAP从受损和死亡的细胞中溢出，进入细胞间隙，可通过血脑屏障进入血液中，使脑脊液及血液中NSE、S100B、GFAP表达增加，可作为定性和定量评价脑损伤的特异指标。

本研究尚存在一定局限性：(1)样本量小，有少部分临床数据缺失(死亡病例后期血清及脑脊液缺失)；(2)无其他颅内感染性疾病患者的横向对比，可能对分析结果造成一定偏倚。因此，NSE、S100B、GFAP对TBM诊断及预后评估价值尚需进行大样本和多中心的研究。

综上，本次研究结果发现，肺结核患儿血清和脑脊液NSE、S100B、GFAP水平增加时，可疑诊TBM，应积极完善头颅影像学及脑脊液结核分枝杆菌病原学检查，以尽早进行干预治疗。TBM患儿入院时NSE≥51.92 μg/L、S100B≥2.75 μg/L或GFAP≥77.54 μg/L，且经治疗脑脊液NSE、S100B、GFAP水平下降缓慢时，提示预后不良的可能，应尽早进行临床干预，降低病亡率和致残率。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献石家云：酝酿和设计实验、分析/解释数据、起草文章、对文章的知识性内容作批评性审阅；王曼知：获取研究经费、指导；周海依和张小佛：对文章的知识性内容作批评性审阅、支持性贡献；危松青：酝酿和设计实验、采集数据、指导、支持性贡献