纳米银和纳米氧化铁对甜瓜白粉病防治研究

董玉昕，郑植，王文康，王志恒，陈晓峰

（中国农业大学烟台研究院，山东 烟台 264670）

甜瓜（Cucumas meloL.）是葫芦科甜瓜属作物，作为重要的畅销水果之一，具有味美香甜、多汁爽口的特点[1]。据2020年联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization)统计，我国甜瓜年种植面积接近4万hm2，年总产量3.5万t，是栽培面积最大、产量最高的国家。由于薄皮甜瓜营养价值高、适用性好、经济效益可观，有巨大的市场前景和发展空间[2]。随着我国甜瓜栽培技术的发展，专业化的种植基地和温室大棚使甜瓜生产能满足人们日益增长的需求[3]。甜瓜白粉病是甜瓜的主要病害之一，主要为害叶片，田间病株率一般在5%~20%，严重时可达到80%，尤其在生长中后期发生严重，发病严重时，叶片枯萎、蜷缩，光合能力下降、丧失，植株停止生长甚至死亡，严重影响甜瓜产量和品质[4-5]，给甜瓜生产带来严重威胁。引起甜瓜白粉病的病原菌主要是单囊壳白粉菌（Sphaerotheca fuliginea）和二孢白粉菌（Golovinomyces cichoracearum）。目前生产中主要通过化学农药防治白粉病，但化学农药使用不规范导致病原菌产生抗药性，单一成分药剂防治愈发困难，同时化学农药的大量使用引发质量安全、环境污染等一系列问题[6-7]，因而寻找一种新型材料成为植物病害防治中的研究热点。

纳米材料是指三维空间中至少有一维结构特征小于100 nm的物质，由于其本身具备的量子尺寸效应、表面界面效应等物理化学特性，在各个领域都表现出重要的研究价值和广泛的应用前景。从20世纪80年代发现纳米材料后，便因其良好的抑菌能力、不产生耐药性、安全无污染特性，被广泛应用于生物、医药、工业和航空航天等领域[8-9]。近几年纳米技术已经应用于农业生产、植物保护和植物营养等领域，成为解决农作物病害防治难题的有效工具。纳米材料按材质可分为金属纳米材料、非金属纳米材料、高分子纳米材料和复合纳米材料，其中金属和金属氧化物纳米材料、非金属氧化物纳米材料对病害抑菌效果或减轻病情指数较为明显[10-14]。纳米材料的抗菌机理主要包括与致病菌代谢酶中的巯基结合使酶失活；与暴露的细菌细胞壁发生肽聚糖反应形成可逆复合物，使细菌不能将氧和能量转运进细胞；与致病微生物的DNA结合，导致DNA结构变性，抑制DNA复制；增加细菌细胞膜通透性，使蛋白质变性的同时释放银离子[15-18]。纳米材料对甜瓜病害有一定的抑制效果，Guo等[19]研究了纳米氧化硅对甜瓜白粉病的抑制机理，结果表明纳米氧化硅处理能显著降低甜瓜白粉病的严重度，适宜的施用浓度对甜瓜白粉病防效达到36.2%。王虎军等[20]报道纳米氧化锌直接抑制病原菌孢子萌发、减缓菌丝生长，对Trichothecium roseum、Fusarium sulphureum、Alternaria alternate分别引起的甜瓜粉霉病、白霉病、黑斑病均具有明显的抑制作用，在一定浓度范围内随着浓度增大抑制作用增强。姚薇等[21]研究发现，纳米银粒子对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporium）有较高的抑制作用，200 mg·L-1纳米银抑菌率可达36.08%。

白粉病对甜瓜产量和品质的为害极大，纳米材料是一种优良的抗菌材料，有助于解决化学药剂防治甜瓜白粉病效果不佳的问题。纳米银具有广谱抗菌、高效持久、不易产生耐药性等特点，已经在医疗卫生、食品保鲜等领域广泛应用[22]；Fe作为植物必需的微量元素之一，同时纳米氧化铁具有较高的抗菌潜力，可用作抗病原菌的抗菌剂[23]，国内对其报道较为少见。过氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（hydrogen peroxidase，CAT）是植物抗病相关的抗氧化酶，其活性高低与植物的抗性反应密切相关，细胞中SOD、POD、CAT 3种保护酶相互协调，以防止过多的自由基对细胞造成毒害。POD与CAT催化H2O2分解从而缓解H2O2对植物造成的伤害[24]，POD活性直接反映了植物组织或植物细胞受胁迫的程度。SOD是重要的超氧阴离子清除剂，在细胞受到外界刺激时通过作用线粒体基质将超氧阴离子歧化为H2O2，以降低植物体活性氧的伤害。丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量可反映细胞脂质过氧化的水平以及生物膜受损伤的程度，是判断膜脂过氧化作用的一个重要指标[25]。本研究选择纳米银和纳米氧化铁作为试验材料，对比不同浓度纳米材料的抗菌活性。但是相同组成成分的纳米材料在不同浓度下表现出不同的抗菌活性，同时有研究表明过量施用纳米金属材料会对植物产生逆境胁迫，本研究比较了纳米银和纳米氧化铁不同浓度下对甜瓜白粉病抗性影响，同时测定甜瓜叶片POD、SOD、CAT活性和MDA含量，比较了不同浓度纳米银和纳米氧化铁对叶片保护酶活性的影响，以期为纳米银和纳米氧化铁在薄皮甜瓜防治的广泛应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以薄皮甜瓜品种“银丰超甜”为试验材料，由中国农业大学烟台研究院提供，该品种易感染白粉病，但对其他真菌病害具有一定抗性。采用温汤浸种进行催芽。将种子放入55~60℃的温水中浸种4 h后用0.2%的高锰酸钾溶液浸种20 min，冲洗干净后在28~30℃条件下催芽，种子大部分露白即可播种。基质采用经过消毒的草炭、蛭石、珍珠岩混合基质（体积比5∶1∶1），将处理过的种子播入已装填基质的育苗盘中，基质覆种1~1.5 cm，浇透水，白天保持温度28~32℃，夜间保持17~20℃进行发芽。参考缪学田[26]的方法进行甜瓜栽培管理。于2021年4月10日定植于中国农业大学烟台研究院试验田。

纳米银，平均粒径20 nm，纯度99.9%，购自上海攀田粉体材料有限公司。纳米氧化铁，平均粒径20 nm，99.9%纯度，购自广州金属冶金有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1Sphaerotheca fuliginea接种液的制备采用山东省海阳市日光温室内自然发病的网纹甜瓜叶片，经光学显微镜（XSZ-2）镜检确认为单囊壳白粉病Sphaerotheca fuliginea生理小种1，将采集的新鲜病叶样品用无菌水冲洗表面灰尘，用软毛刷把病原菌刷入无菌水中，通过血球计数板镜检计数，配成1×105cfu·mL−1孢子囊悬浮接种液[27]。

1.2.2 试验处理试验设纳米银处理（T1处理）和纳米氧化铁处理（T2处理），其中T1处理共分4个浓度处理，分别为1.25（T1-1）、2.50（T1-2）、5.00（T1-3）、10.00μmol·mL−1（T1-4）；T2处理也分为4个浓度处理，分别为1.25（T2-1）、2.50（T2-2）、5.00（T2-3）、10.00μmol·mL−1（T2-4）。以纯水为对照组，每个处理设置3个重复，每个处理20株。

1.2.3 纳米材料的制备、喷施和病原菌的接种配制不同浓度梯度的纳米金属溶液，为防止纳米材料在溶液中产生团聚，喷施前需置于超声波清洗器中超声30 min。

于甜瓜4叶1心时选取长势一致的瓜苗，用小型手持喷雾器将纳米银溶液和纳米氧化铁溶液分别对供试幼苗心叶进行喷雾，以叶片湿润为宜。24 h后将配置好的甜瓜白粉病病原菌接种液喷到展平的甜瓜叶片上，接种后植株置于人工气候箱中黑暗保湿24 h，然后进行正常的12 h/12 h光暗周期培养，控制温度范围为20~25℃，相对湿度控制85%±5%，接种7 d后调查发病情况[28-29]。

1.3 测定项目

分别在接种病原菌后0、24、48、72、96 h采集叶片，测定POD、SOD、CAT活性以及MDA含量[30]。

1.4 病情分级标准

接种7 d后待病情充分发生且稳定后调查病情级数和病情指数，分级标准[31]见表1，并按照公式（1）计算病情指数[32]。

表1 室内苗期抗病性鉴定病情分级标准Table 1 Grading criteria for identifying disease resistance of seedlings indoors

1.5 数据分析

采用Microsoft Office Excel 2016，SPSS 26.0对数据进行多重比较和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 纳米材料对甜瓜叶片白粉病病情指数影响

由表2可知，纳米银和纳米氧化铁对甜瓜叶片白粉病均有一定的抑制作用，减少了叶片病情指数，除T2-1外，所有处理均显著降低了甜瓜叶片白粉病病情指数。不同浓度处理导致病情指数差别明显，其中，T2-4处理白粉病病情指数减少最多，比对照减少34.96%；其次为T1-4处理，减少32.52%；然后是T1-3处理，病情指数减少31.39%；T2-3处理病情指数减少27.07%。不同浓度的纳米材料对甜瓜白粉病的抑制效果有差异，随着浓度的增加，处理后甜瓜叶片病情指数均有所降低。T1-4处理甜瓜叶片出现发黄、萎蔫的情况，可能是由于高浓度纳米金属材料对植物的影响[33]。

表2 纳米银和纳米氧化铁处理后的甜瓜叶片白粉病病情指数Table 2 Disease index of powdery mildew on melon leaves treated with Nano-silver and Nano-iron oxide

2.2 纳米材料对叶片POD活性的影响

由图1可知，纳米银喷施+病原菌接种处理后，叶片POD活性显著高于对照，2组处理POD活性呈现先升高后降低的变化趋势。T1-2、T1-3、T1-4处理叶片POD活性在接种24 h后显著升高，72 h达到峰值，且与对照存在显著差异（P<0.05）；T1-3处理POD活性始终高于其他处理，接种72 h后，T1-3处理比对照高156.6%；T1-4处理由于较高的纳米银浓度导致叶片出现发黄、萎蔫现象。由此可知，适宜浓度的纳米银喷施处理能显著提高甜瓜叶片中的POD活性，但使用高浓度喷施处理，POD提升与较低浓度相比不显著，会造成一定的毒害作用。

图1 不同处理下甜瓜叶片的POD活性Fig.1 POD activity of melon leaves under different treatments

纳米氧化铁喷施+病原菌接种处理后，叶片POD活性显著高于对照，接种24 h后处理组与对照组存在显著差异（P<0.05）。随处理时间增加，甜瓜叶片中POD活性均呈现上升趋势，72 h达到最大值，此时处理组比对照提高了123.0%~160.1%；处理96 h后，对照和处理组叶片POD活性都出现下降趋势。由试验结果可知，浓度为10μmol·mL-1以下的纳米氧化铁喷施处理显著提高甜瓜叶片POD活性。

2.3 纳米材料对叶片SOD活性的影响

由图2可知，纳米银喷施+病原菌接种处理后，处理组叶片SOD活性整体呈先升后降趋势，在处理72 h达到顶峰，在96 h出现小幅度下降，对照组呈缓慢上升的趋势；处理组在24 h以后酶活性显著高于对照，在处理24~96 h时间段，T1-2、T1-3、T1-4处理组酶活性比对照组增加明显，T1-3处理72 h酶活性最高，为376.0 U·g-1FW，比对照高99.3%，T1-1处理在72~96 h酶活性与对照相差不大。由此可知，适宜浓度的纳米银喷施处理能显著提高甜瓜叶片SOD活性，但使用高浓度喷施处理可能会出现抑制效果减弱的情况。

由图2可知，随着纳米氧化铁喷施浓度的提高，处理和对照组SOD活性呈现增高趋势，处理组SOD活性均高于对照，且T2-4处理SOD活性均大于其他处理，T2-4处理在96 h酶活性达到最大值，比对照高85.6%。

图2 不同处理下甜瓜叶片SOD活性的变化Fig.2 SOD activity of melon leaves under different treatments

随着处理时间增加，T2比T1处理对酶活性影响大，处理24 h后就始终高于同时间点T1处理。与纳米银处理不同的是，纳米氧化铁处理96 h酶活性依然表现出上升趋势。试验说明，纳米氧化铁喷施处理可以显著提高甜瓜叶片SOD活性，随浓度增加甜瓜叶片SOD活性呈上升趋势。

2.4 纳米材料对叶片CAT活性的影响

由图3可知，纳米银喷施处理后甜瓜叶片CAT活性低于对照，且不同处理间叶片的CAT活性随处理时间整体呈现下降趋势。处理24 h，T1处理CAT活性较对照出现显著下降，下降范围为60.4%~84.2%，由此可知，适宜浓度的纳米银喷施处理长时间作用后能显著降低甜瓜叶片中的CAT活性，尤其显著降低接种病原菌初期的CAT活性。

图3 不同处理下甜瓜叶片CAT活性Fig.3 CAT activity of melon leaves under different treatments

纳米氧化铁喷施处理使得接种病原菌后甜瓜叶片CAT活性呈上升趋势，在处理96 h后酶活性达到顶峰，其中T2-4处理96 h酶活性最大，为80.4 U·g-1FW，较对照上升117.3%。T2-1、T2-2处理和CK无显著差异（0~48 h），随着处理时间增加，T2处理组CAT活性逐渐升高（72~96 h），在96 h处酶活性比对照高39.6%~125.8%。由此可知，在短时间内纳米氧化铁处理对甜瓜叶片中的CAT活性影响不大，随处理时间的增加，CAT活性与处理浓度才呈现一定正相关性。

2.5 纳米材料对叶片MDA含量的影响

由图4可知，喷施纳米银+病原菌接种处理后随时间增加，各处理的叶片MDA含量整体呈现出先上升后下降的趋势，且均在接种后72 h达到顶峰，随后迅速下降，同一处理时间点纳米银喷施处理MDA含量均低于对照，且随纳米银浓度增加MDA含量下降，各处理间差异不显著。T1-4处理48 h MDA含量为对照的83.5%，72 h为85.7%。由此可知，白粉病病原菌侵染后叶片MDA含量呈现先上升后下降的趋势，喷施纳米银可以降低叶片MDA含量。

图4 不同处理下甜瓜叶片MDA含量Fig.4 MDA content of melon leaves under different treatments

纳米氧化铁喷施处理后，MDA总体变化趋势与纳米银处理一致，整体呈现出先上升后下降的趋势，但对照组MDA含量最高点出现在72 h，最大值为3.59 nmol·g-1FW，处理组则出现在48 h，MDA含量为对照的82.3%~100.6%。对照MDA含量在0、24 h处显著低于处理组，72 h处显著高于处理组，不同处理间在96 h处差异不显著。

3 讨论

在设施农业生产中，由于处于密闭环境中，高温高湿条件往往会导致作物病害加重[34]。白粉病作为甜瓜的主要病害，多年化学防治后极易导致病原菌产生一定的抗药性，药剂防治效果不佳[35]。近些年国内外学者对纳米材料在植物病害防控方面进行了大量研究，并取得显著的效果。纳米材料可提高植物对病害的抗性原因可能有两方面，一方面是来自其本身的抗菌性，另一方面是可以诱导植物产生抗病性。Chen等[11]研究发现，GO/Ag-NPs复合材料的抗菌机理主要表现为物理损伤细胞结构和诱导病原体产生相对活性氧的协同作用，从而造成菌体死亡。Imada等[36]用MgONP预处理番茄根部显著抑制青枯病的发展，推测MgONP诱导了番茄植株对青枯病的抗性。本试验着重研究纳米银和纳米氧化铁对甜瓜抗白粉病和甜瓜叶片酶活性的影响。

已有研究证明，纳米银具有抑制病原菌的作用，其对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌表现出强烈的杀菌性，可以作为潜在的抗真菌药剂[37-38]。Ali等[39]报道了纳米银对疫霉菌属（Phytophthora）100%有效抑制菌丝生长。纳米银的抑菌机理主要存在2种解释，一种是通过吸附并穿透病菌细胞壁，致使病菌蛋白质凝固而丧失分裂能力死亡，另一种是Ag+与周围的水或空气作用，产生活性氧物质进而攻击细胞膜，导致细菌死亡[40]。甘林等[41]发现，纳米银会显著抑制甘蓝黑腐病病原菌（Xanthomonas.campestris pv.campestris）的呼吸强度，抑制细菌生长，这与本研究田间试验中甜瓜叶片病情指数随纳米银浓度增加，病情指数呈下降趋势结果一致。同时，纳米银还具有影响酶活性的作用[42]，纳米银能提高植物体内的POD、SOD和可溶性蛋白含量。本研究中不同浓度纳米银处理甜瓜叶片后，甜瓜叶片POD、SOD活性在一定时期内显著升高，同时一定浓度范围内，随浓度的提高处理酶活性、酶活性增幅更高；经纳米银处理后CAT活性低于对照，这与Hu等[43]发现纳米颗粒能引起植物体细胞的氧化胁迫效应一致。本试验发现在浓度为10μmol·mL-1时，甜瓜叶片表现出发黄、萎蔫的情况，有研究[44]表明，高浓度纳米金属材料会抑制植物的蒸腾作用，植物处于逆境胁迫时需要抗氧化酶在一定程度上减轻或抵御胁迫伤害，通过减少过量的活性氧并维持正常的代谢平衡、保护膜结构等。本研究发现，不同浓度纳米银喷施处理后，甜瓜叶片MDA含量增幅明显小于对照，表明在病原菌侵害后，纳米银喷施处理的甜瓜叶片中积累的自由基较少，细胞膜系统受损程度相较于对照要小。纳米银粒子释放到自然界后是否会造成环境污染等还需要进一步研究。综上所述，本研究认为浓度为5μmol·mL-1的纳米银抗甜瓜白粉病效果较优。

铁是植物生长发育过程中不可缺少的元素之一，具备成为良好无机抑菌材料的条件，Tyagi等[23]研究发现FeNPs可以作为抗病原体的抗菌剂。在低浓度时纳米氧化铁材料与纳米银对于白粉病病情指数的影响无差异，高浓度处理时较同浓度纳米银有较好的抗病效果，本研究中纳米氧化铁浓度为10μmol·mL-1的抗病效果较优，能显著降低甜瓜叶片的病情指数。纳米氧化铁在试验中尚未表现出使甜瓜叶片发黄、萎蔫的情况，本研究认为10μmol·mL-1的纳米氧化铁具有较好抗甜瓜白粉病的效果。纳米氧化铁对于植物同样具有胁迫作用[45]，在试验中并未表现出胁迫作用，可能是浓度较低并未引起严重的胁迫效应。低浓度纳米银和纳米氧化铁对甜瓜叶片病情指数和酶活性的影响无差异，10μmol·mL-1时纳米氧化铁对甜瓜白粉病的防治效果优于同浓度的纳米银。纳米氧化铁处理后，甜瓜叶片POD、CAT活性显著高于对照，其中纳米氧化铁胁迫产生的氧自由基破坏了植物体细胞功能膜及酶系统，持续的氧化应激反应促进POD、CAT活性显著增强；MDA含量先上升，96 h后急速下降，与赵铭等[46]发现植物体内的SOD、POD、CAT联合作用清除了植物体内过多的活性氧的研究结果一致。

综上所述，甜瓜白粉病原菌对于传统药剂防治有一定的抗性，防治效果不明显，而纳米银和纳米氧化铁对于其有较好的防治效果，在植物病害防治应用方面具有良好的前景。同时需要注意的是，高浓度纳米银对植物体有一定的损伤，在实际生产中要合理施用纳米银溶液，按照生产条件和发病情况灵活施用以降低甜瓜白粉病带来的经济损失，使甜瓜生产达到最佳的经济效益。