Wnt5a介导Wnt/Ca2+通路对BCG诱导牛原代肺泡上皮细胞自噬的调控作用

陈 琪，杜长征，郑雪迪，马伯利，徐金瑞*，杨 易*

(1.宁夏大学 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川 750021；2.宁夏大学生命科学学院，银川 750021)

2021年世界卫生组织(WHO)发布的《2021年全球结核病报告》显示，2020年全球结核潜伏感染人群近20亿，新发结核病(tuberculosis，TB)患者约987万，发病率为127/10万，我国估算结核病发病数位居世界第2位，死亡率为2.1/10万，由于新型冠状病毒肺炎(COVID-19)大流行，结核病死亡人数出现了十余年来的首次增加[1]。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)是结核病的致病菌，其通过宿主代谢和能量代谢途径侵扰受感染细胞的自噬和凋亡[2]，Mtb可侵入机体各种器官，主要是肺，引起肺结核[3]。肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells，AECs)是抵抗外来物入侵的第一道防线，在肺免疫中担负着由先天免疫到获得性免疫的桥梁作用[4]。Mtb在AECs内有更高的复制增殖能力，刺激AECs分泌各种细胞因子，产生细胞毒性，以促进Mtb的传播和结核病的发生与发展[5]。虽然目前有多种方法来分离AECs，但仍未有一种公认的方法能够得到纯度高且产量大的上皮细胞，因此，探讨高效分离培养原代AECs的方法对肺功能特性研究意义重大。

自噬在维持细胞体内平衡中起着至关重要的作用，在调控细胞命运和抗感染性疾病进程中至关重要[6]。Wnt5a是Wnt蛋白家族成员之一，通过与膜受体或共受体复合物结合激活细胞中磷酸化蛋白传递信号，既作用于经典Wnt/β-catenin信号通路，又活化非经典Wnt信号通路[7]。Wnt5a通过激活钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II(calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)及钙调磷酸酶的作用，促进细胞内Ca2+释放，使胞内Ca2+浓度升高，活化T细胞核因子(nuclear factor of the activated T cell, NFAT)，发挥抑癌作用[8-9]。胞内Ca2+在自噬调控中起着重要作用[10]，也在结核发病机制中起着至关重要的作用，Mtb操纵Ca2+信号以阻止吞噬体成熟及吞噬体和溶酶体融合的能力被广泛研究[11]，特异性阻断Ca2+显著减少自噬小体的形成，且升高Mtb细菌载量，表明Ca2+在Mtb胞内存活和细胞自噬中发挥重要作用[12]。但Ca2+在Mtb感染过程中调节自噬的确切作用尚不清楚，因此，探讨Wnt5a是否通过非经典Wnt/Ca2+信号通路调控BCG感染的BAECs细胞自噬，对宿主导向的抗结核治疗方法的研究具有重要意义。

本课题组前期已证明Wnt5a对BCG感染的小鼠肺上皮细胞自噬有调控作用[13]，因此，本研究通过分离BAECs，用BCG感染BAECs建立模型，抑制Wnt5a的表达处理，Western blot和免疫荧光染色检测自噬相关蛋白及非经典Wnt/Ca2+信号通路相关因子的蛋白水平表达，以明确Wnt5a对BCG感染的BAECs细胞自噬的调控机制，为肺结核治疗和预防提供新视角。

1 材料与方法

1.1 试验材料

成年健康牛肺组织。

1.2 主要试剂及仪器

硫酸链霉素、氨苄青霉素(Amersco，美国)，两性霉素(Sigma，美国)，胶原酶I(Gibco，美国)，RNase-Free DNase I、红细胞裂解液(天埂生化科技有限公司)，Biolaminin包被液(上海逍鹏生物科技有限公司)，Wnt5a特异性抑制剂Box-5(Sigma，美国)，DMEM/F12培养基(BI，美国)，胎牛血清及TrypleTM胰酶(Gibco，美国)，青霉素/链霉素溶液(北京索莱宝科技有限公司)，全蛋白提取试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司)，BCA蛋白含量检测试剂盒(南京凯基公司)，脱脂奶粉(BD，美国)，一抗Cytokeratin14、Cytokeratin5、Atg5、P62、内参GAPDH兔多克隆抗体、二抗HRP-Goat、LC3荧光一抗和山羊抗兔荧光二抗(Proteintech，美国)，LC3一抗(CST，美国)，Atg7一抗(Abcam，美国)，预染彩虹蛋白Marker(大连美伦生物技术有限公司)，ECL 显影液(环亚生物科技有限公司)，4%多聚甲醛(BD，美国)，Triton X-100(Sigam，美国)，封闭用驴血清、含DAPI 的荧光封片剂(北京索莱宝科技有限公司)。CO2细胞培养箱(SANYO，日本)，全自动细胞计数仪(Bio-Rad美国)，高通量组织细胞破碎仪(北京仪嘉林科技有限公司)，电转仪和电泳仪(Bio-Rad，美国)，GE化学发光检测仪(Gene，美国)，光学显微镜(Motic公司，中国)，荧光显微镜(Olympics，日本)。

1.3 结核分枝杆菌BCG来源及培养

将购自成都生物制品研究所有限公司牛结核分枝杆菌卡介苗(BCG)疫苗株粉末用7H9培养液(含0.2% Tween-80和10% ADC)溶解重悬，置于细胞培养瓶中于饱和湿度、5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，待达到对数生长期时进行感染试验。

1.4 牛原代肺泡上皮细胞的分离培养

参考Xu等[14]和廖伟等[15]分离原代肺上皮细胞的方法，并进一步优化：取成年健康牛肺组织，纵切支气管并切成小块，置于无菌50 mL离心管，加入预冷的PBS(含双抗及两性霉素B)漂洗至洗液澄清。将组织块置于预冷消化液(PBS+20% DMEM+15%胎牛血清+5%双抗+1 g·L-1胶原酶I+胰酶+10 mg·L-1DNase I+2.5 mg·L-1两性霉素B)，放入4 ℃冰箱消化至出现浑浊，加等体积PBS终止消化。将管腔面向上，刮刷管腔，收集洗液，1 000 r·min-1离心5 min，加入红细胞裂解液去除红细胞，补加DMEM/F12培养液(DMEM/F12+12%胎牛血清+1%双抗)于200目细胞筛过滤，接种于培养皿中2～4 h，使易于贴壁的成纤维细胞等贴壁。收集未贴壁的细胞悬液，1 000 r·min-1离心5 min，用含DMEM/F12培养液重悬，接种于提前用Biolaminin包被液包被的培养皿中，饱和湿度下，5% CO2，37 ℃培养。

1.5 BAECs鉴定

将分离的细胞以2×105个·孔-1接种于提前放置玻璃片的12孔板中贴壁8 h，弃培养液，PBS漂洗， 5 min×3；4% 多聚甲醛固定20 min，同上PBS漂洗；0.2% TritonX-100通透细胞20 min，PBS漂洗；10% 驴血清/PBS封闭1 h，PBS润洗，5 min×2；37 ℃静置孵育CK14和CK5一抗(稀释比 200∶1)2 h，PBS洗涤后37 ℃避光孵育荧光二抗(稀释比100∶1)30 min，PBS洗涤3次后用含DAPI 封片剂染核指甲油封片，荧光显微镜观察结果。

1.6 BCG感染及抑制Wnt5a处理BAECs

待BAECs生长至80%左右时，用胰酶消化后台盼蓝染色计数，将细胞以4×105个·孔-1接种于6孔板培养皿，贴壁8 h，弃培养基，补加1 mL培养液，根据已有试验[13]基础用感染复数10∶1的BCG感染BAECs 4 h，设置对照组(C组)和BCG感染组(BCG)；不同浓度Wnt5a特异性抑制剂Box-5处理BAECs 6 h收样，设置对照组(C组)及Box-5浓度为5、10、30、50和100 μmol·L-1处理组；用适宜浓度Box-5预处理BAECs 2 h，BCG继续感染BAECs 4 h(MOI=10)，设置对照组(C组)，BCG感染组(BCG)，Box-5 抑制剂组(Box-5)和抑制剂与BCG共处理组(Box-5+BCG)。

1.7 总蛋白提取及Western blot检测

将不同处理组BAECs用PBS缓冲液润洗2次，每孔加100 μL全蛋白裂解液，置于4 ℃摇床15 min，使细胞充分裂解。将细胞刮下，收集于提前加了细胞磁珠的1.5 mL离心管中，置于细胞破碎仪破碎1 min左右至裂解液澄清，于低温离心机离心(4 ℃，14 000 r·min-1，15 min)，收集上清液。BCA检测试剂盒测定蛋白浓度后定量加入上样缓冲液，于沸水浴灭活5 min后于-20 ℃保存备用。将30 μg变性蛋白经SDS-PAGE电泳后，湿转至PVDF膜上，用含5% 脱脂奶粉的TBS室温封闭2 h，TBS洗涤，4 ℃过夜孵育一抗，TBST洗涤，室温孵育二抗2 h， TBST洗涤，加ECL化学发光液，用GE化学发光检测仪记录蛋白条带。

1.8 免疫荧光染色检测

将BAECs以2×105个·孔-1接种于提前放置玻璃片的12孔板中贴壁8 h，同“1.6”处理，弃培养基用PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗涤5 min×3，0.2% Triton X-100通透 20 min，PBS洗涤5 min×3，用10%的驴血清室温静置封闭1 h，PBS洗涤5 min×2，37 ℃静置孵育LC3一抗(一抗稀释液按照稀释比200∶1稀释)2 h，PBS洗涤5 min×3，37 ℃避光孵育荧光二抗(PBS按照稀释比100∶1)30 min，PBS洗涤5 min×3，用含DAPI 封片剂染核指甲油封片，荧光显微镜观察结果。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 牛肺泡上皮细胞的分离培养

对牛肺组织进行细胞分离，在培养36 h视野中出现明显的细胞团(图1A)，第一代细胞经胰酶消化离心重悬后，用台盼蓝染色计数发现细胞活率均在85%～92%之间，显微镜观察传代培养24 h细胞形态(图1B)。

A. 分离培养36 h原代细胞；B. 传代培养24 h的原代细胞

2.2 牛肺泡上皮细胞鉴定

2.2.1 免疫荧光染色检测CK14的表达 为了鉴定分离肺细胞类型，依据上皮细胞类型的特异性表面标记抗原，CK14是一种具有特异性的上皮标记蛋白[16]，免疫荧光染色检测CK14的表达，结果发现绝大部分细胞表达CK14(图2)，提示分离的肺细胞是BAECs。

免疫荧光染色检测细胞CK14的表达，CK14为绿色，DAPI为蓝色；A～C. 放大倍数100；D～F. 放大倍数200

2.2.2 免疫荧光染色检测角蛋白5的表达 CK5为细胞骨架中间丝蛋白，具有维持上皮细胞形态完整性作用，免疫荧光染色检测CK5的表达，结果显示绝大部分细胞表达CK5(图3)，进一步表明分离的细胞是BAECs。

免疫荧光染色检测细胞CK5的表达，CK5为绿色，DAPI为蓝色；A～C. 放大倍数100；D～F. 放大倍数200

2.3 BCG感染对BAECs自噬相关蛋白及Wnt5a表达的影响

为确定BCG感染BAECs的细胞自噬及Wnt5a表达水平，用BCG感染BAECs后，Western blot检测细胞内Wnt5a及自噬相关因子 LC3蛋白水平表达。结果显示，相较对照组(C组)，BCG组Wnt5a及自噬相关蛋白LC3II蛋白表达水平均显著升高(P<0.01，图4)，表明BCG感染BAECs上调Wnt5a表达水平，增加细胞自噬。

A. 蛋白表达印迹图；B、C.直方图。**. P<0.01，下同

2.4 不同浓度Box-5作用BAECs后Wnt5a及细胞自噬相关蛋白的表达

为了确定Wnt5a特异性抑制剂Box-5抑制Wnt5a的表达水平，不同浓度Box-5作用BAECs，Western blot检测胞内Wnt5a及自噬相关蛋白LC3表达水平显示，Box-5浓度为50 μmol·L-1时Wnt5a的表达水平显著低于其他组(P<0.001)，且LC3II较C组(0 μmol·L-1)显著升高(P<0.001,图5)。因此确定Box-5处理浓度50 μmol·L-1为抑制BAECs中Wnt5a表达的最适浓度。

A. 蛋白表达印迹图；B、C. 直方图。ns.无差异；*. P<0.05；***. P<0.001。下同

2.5 Wnt5a对BCG诱导BAECs自噬相关蛋白表达的影响

为确定Wnt5a对BCG感染BAECs自噬的调控作用，用Box-5与BCG单独或共处理BAECs，Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Atg5、Atg7及P62的表达水平，结果显示， Box-5+BCG组较BCG组自噬相关因子LC3II、Atg5、Atg7及P62的蛋白水平表达均明显降低(P<0.01,图6)。表明Wnt5a对BCG诱导的BAECs细胞自噬有调控作用，且抑制Wnt5a的表达下调BCG诱导的BAECs细胞自噬。

A. 蛋白表达印迹图；B～E. 直方图

2.6 Wnt5a对BCG诱导BAECs自噬体形成的影响

LC3是自噬体成膜过程中的重要参与因子，被用来作为自噬体形成的标记[18]，自噬形成时，RFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成荧光斑点。为了进一步探究Wnt5a对BCG感染的BAECs细胞自噬的调控作用，免疫荧光染色检测BAECs内LC3绿色荧光斑点数量及亮度。结果显示，BCG感染BAECs内LC3荧光斑点(绿色)数量与荧光强度较C组均明显增加，且Box-5+BCG 组较BCG 组细胞荧光斑点数量和强度均明显降低(图7)。表明抑制Wnt5a对BCG感染BAECs细胞自噬体的形成有抑制作用，进一步证明抑制Wnt5a的表达下调了BCG诱导的BAECs细胞自噬。

免疫荧光检测细胞内LC3的表达，LC3为绿色，DAPI为蓝色，放大倍数100

2.7 Wnt5a调控BCG诱导的BAECs细胞自噬机制

为了探讨Wnt5a调控BCG感染的BAECs细胞自噬机制，用Box-5及BCG单独或共处理BAECs，Western blot检测非经典Wnt/Ca2+通路相关因子Wnt5a、CaMKII及NFAT蛋白水平表达。结果显示，BCG感染BAECs内Wnt5a、CaMKII及NFAT的蛋白水平较C组均升高(P<0.05)，Box-5+BCG组相较于BCG组Wnt5a、CaMKII及NFAT的蛋白水平均降低(P<0.05,图8)，结果表明，Wnt5a介导非经典Wnt/Ca2+通路调控BCG诱导的BAECs细胞自噬。

A. 蛋白表达印迹图；B. 直方图

3 讨 论

结核病是由Mtb感染引发通过呼吸道传播的人畜共患传染病，也是世界上最致命的单一病原体死因，肺结核为最常见的结核病[19]。肺作为机体与外界之间的主要屏障，通过不同类型上皮细胞组成一层连续的上皮细胞层，构成对吸入物质和病原体的物理和生物屏障[20]，肺上皮细胞是抵御肺部感染的第一道防线，具有防止病原体和毒素侵害的作用[21]，也是微生物防御的积极效应器，对肺的先天免疫功能和适应性免疫功能都起着重要的作用[22]。目前分离BAECs方法有机械分散法、组织块培养法和酶消化分离法等，各有优缺点[23-24]。本研究采用酶联合消化法和机械刮刷法获取BAECs，而在分离BAECs过程中可能混合其他细胞(如纤维细胞和肌肉细胞等)，利用不同细胞贴壁时间不同，差速贴壁纯化BAECs。角蛋白(cytokeratin，CK)是细胞骨架中间丝蛋白，特异性表达于上皮细胞，其在维持上皮细胞形态完整性中扮演重要角色[25-26]，研究表明，CK14是上皮细胞基底细胞特异性表面标记抗原[27-28]，CK5为细胞骨架中间丝蛋白，具有维持上皮细胞形态完整性作用，因此，本研究将CK5和CK14作为鉴定上皮细胞的标记，采用免疫荧光鉴定分离的细胞，发现分离纯化的上皮细胞纯度极高，因此，本研究提供了一种纯度较高的分离BAECs的方法，对探究牛属动物结核病感染及发病机制具有重要作用。

自噬是一种细胞内分解代谢过程，通过溶酶体降解过程维持体内平衡或清除入侵的病原体，自噬及其相关途径是免疫和炎症的中心稳态机制[29]。Wnt5a是一种主要的非经典Wnt配体，存在于上皮细胞中[30]，Wnt5a 介导相关自噬通路是宿主细胞先天免疫的重要组成部分，也是限制病原菌感染的关键[31]。ESAT-6分泌系统-1(ESX-1)作为Mtb毒力决定因子，ESX-1基因是阻止吞噬体成熟的关键，由RD1基因位点编码，缺乏RD1是导致BCG毒力减弱的原因，也是诱导细胞自噬关键[32]。因此，研究Wnt5a与自噬的关系对肺结核的预防和治疗具有现实意义。本研究探讨抑制胞内Wnt5a对BCG感染BAECs细胞自噬的影响，结果表明Wnt5a对BCG诱导的BAECs细胞自噬有调控作用，且抑制Wnt5a的表达下调了BCG诱导的BAECs细胞自噬。进一步探究 Wnt5a对 BCG诱导BAECs细胞自噬的调控机制对结核预防和治疗具有重要意义。

Wnt5a与细胞膜上的Fzd受体和Ror2受体结合，通过CaMKII及钙调磷酸酶的作用，引起细胞内Ca2+浓度的增加，进而激活非经典Wnt/Ca2+信号途径。Ca2+在结核发病机制中起着至关重要的作用，Mtb操纵Ca2+信号以阻止吞噬体成熟及吞噬体和溶酶体融合的能力已被广泛研究[33]。Kim等[34]在体外试验中发现Wnt5a/Ca2+信号通路在炎症内皮细胞中被激活，能迅速诱发COX-2、IL-6 及IL-8 等炎性因子的表达；BLANC等[35]发现，Wnt5a 通过Wnt/Ca2+信号参与神经母细胞瘤的发病；也有研究发现非经典Wnt5a/Ca2+/CaN/NFAT信号在胚胎手指细胞发育中发挥了关键作用[36]，非经典Wnt/Ca2+信号途径成为目前研究的热点。本研究探究抑制Wnt5a对BCG感染BAECs的Wnt/Ca2+信号通路相关蛋白表达的影响，结果表明，Wnt5a介导非经典Wnt/Ca2+信号通路调控BCG诱导BAECs细胞自噬。根据是否有 mTOR信号参与可将自噬分为 mTOR 信号依赖性自噬和mTOR非依赖性自噬[37]，异丙酚通过Ca2+/CaMKKβ/AMPK/mTOR通路抑制自噬而介导氧糖剥夺再充氧诱发的神经元损伤[38]，细胞内Ca2+浓度的积累激活CaMKKβ/AMPK信号级联，导致mTOR信号抑制，从而诱导自噬[39]，因此，Wnt5a/CaMKII对BCG诱导BAECs细胞自噬的调控所依赖的自噬通路有待进一步探究，这将为结核病预防和控制提供新依据。

4 结 论

应用胶原酶I、胰酶和DNase I酶联合消化法结合细胞刮刷法，成功分离培养纯度和活率较高的BAECs，BCG感染促进BAECs胞内Wnt5a的表达及细胞自噬，抑制Wnt5a的表达下调BCG诱导的BAECs细胞自噬，且Wnt5a介导非经典Wnt/Ca2+信号通路调控BCG诱导的BAECs细胞自噬。