基于PCR和LFS技术的掺假豌豆成分快速检测

王 凯, 屈 玮, 姚帮本,2, 徐建国, 姚 丽

(1.合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601;2.安徽省产品质量监督检验研究院,安徽 合肥 230051)

目前掺假问题已成为包括加工、流通和餐饮在内的整个食品供应链中的质量问题。掺假通常是指在高价原料中掺入配料或替代较便宜的配料,以赚取更多利润和/或在食品制造、加工、包装或储存过程中不遵守卫生规则[1]。市面上已经出现各种掺假行为,包括油、蜂蜜、乳制品、果汁、咖啡、面粉和肉类产品等掺假[2-4]。近年来,也出现各种豆类掺假现象,以绿豆食品为例,一些企业为获取高额利润,常利用豌豆、大豆等其他原材料充当绿豆食品出售[5-6],特别在绿豆糕中,有些绿豆糕中豌豆占主要成分。这些对消费市场产生了负面影响,损害了国民经济,在某些情况下对特殊人群(如过敏反应者)产生健康威胁。为了防止此类食品欺诈事件的发生,需要开发一种可靠且灵敏的分析工具,以便对豆类品种进行鉴定。

针对掺假检测,研究人员基于蛋白质和DNA分析技术开发了许多掺假材料定性和定量分析方法。基于蛋白质的检测方法,包括高效液相色谱、电泳技术和酶联免疫吸附测定等[7-8],在物种鉴定中显示出令人满意的结果。但该方法取决于多肽靶标的检测,该靶标始终是组织依赖性的[9],当经过热处理时,它们较低的灵敏度缺点就会显现,并且这些检测方法大多需要昂贵仪器、危险有毒样品制备以及熟练的人员,相对来说难以准确、方便且廉价地进行掺假的检测。与基于蛋白质检测方法相比,基于DNA的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)被认为是一种更可靠稳定的方法。首先,DNA可以承受高温引起的降解,因此,足够长且完整的片段仍可用于扩增[10];其次,PCR扩增以高灵敏度和特异性为特征,可以通过非常少量的DNA分析就能检测出低含量的豌豆掺假。此外,基因组DNA可以从任何植物组织中提取,并且不受环境条件或植物发育阶段的影响[11]。但在所有PCR方法中,用于物种鉴定的直接PCR分析都需要凝胶电泳相配合[12],电泳检测步骤相对繁琐,检测时间长,并且会接触有毒甚至致癌药物。然而,用于常规验证检测和现场检测的侧向流试纸条(lateral flow strip,LFS)技术成为PCR后电泳检测良好的替代方法。对于PCR-LFS检测,首先需要在5’端标记基因特异性引物(例如,通过生物素和荧光素修饰),然后用于扩增,最后使用试纸条检测标记PCR产物[13]。由于LFS技术易于使用,反应迅速且价格合理,同时该技术无需经过培训的操作人员和配备精良的实验室即可对待检成分进行适当的检测,使其被越来越广泛地使用。此外,由于其响应时间短(5～10 min),并且可以进行原位测试,因此可以在短时间内采取纠正措施。

本文采用PCR和LFS相结合方法,对绿豆食品中的掺假豌豆成分进行快速检测。实验采用稳定和高效的PCR技术,扩增出生物素(Biotin)和异硫氰酸荧光素(FITC)双标记的特异性的豌豆基因产物,然后用识别目标分析物的LFS技术进行检测,可以在2 h内快速、方便地对掺假豌豆成分进行可视化鉴别,该方法仅依靠肉眼观察或便携式设备就可以进行图像的检测和分析。

1 材料方法

1.1 实验样本

实验所需的豌豆、绿豆、黑豆、红豆、蚕豆和芸豆等均在超市购买。掺假样本的制备是先将绿豆和豌豆磨成粉,然后将豌豆粉末按照质量分数100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%的比例掺入绿豆粉中作为掺假样本。

1.2 实验试剂

三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、盐酸、乙二胺四乙酸、硼酸、氯化钠、氢氧化钠、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、彩色乳胶微球和其他实验中所用的化学试剂均购于国药集团化学试剂有限公司;链霉亲和素(SAV)、牛血清蛋白(BSA)、dNTP混合液、蛋白酶K,核糖核酸酶、DNA Marker,4S Red plus核酸染料、琼脂糖粉末、TBE粉末等均购于生工生物工程(上海)股份有限公司;FITC抗体、二抗均购于广州格瑞林生物科技有限公司;结合垫、样品垫、聚氯乙烯(PVC)结合垫、吸收垫和硝酸纤维素(NC)膜均购于洁宁生物技术公司;实验所需FITC和Biotin功能化修饰上下游引物由通用生物系统有限公司合成。

1.3 实验仪器

实验所用仪器有粉碎机、分析天平、水浴锅、PCR仪、电泳仪、核酸测定仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、纯水仪、恒温干燥箱、pH计、喷膜机和全自动切条机等。

1.4 DNA提取

本实验采用磁珠法提取DNA,该方法参考文献[14]方法并稍做修改。将豌豆用粉碎机磨成粉,称取50 mg豌豆粉加入1.5 mL 离心管管中,然后加入700 μL SDS缓冲液,30 μL蛋白酶和5 μL核糖核苷酸酶,在65 ℃水浴锅中加热1 h。水浴完成后,冷却至室温,12 000 r/min离心1 min,取上清加入新的离心管,加入1/10体积分数醋酸钾溶液,冰水浴10 min。水浴完成后,12 000 r/min离心10 min,取上清加入新的离心管,加入10 μg磁珠,混匀,再加入1/2体积分数PEG/NaCl溶液,混匀5 min。之后用磁力架磁力吸附弃上清,用1 mL 75%乙醇清洗3次,37 ℃烘箱干燥10 min。干燥完成加入100 μLTE缓冲液,65 ℃水浴10 min,磁力吸附取上清加入到新的离心管,离心管中液体即为提取的豌豆DNA。

1.5 乳胶微球与抗体偶联

乳胶微球与抗体偶联参考文献[15]方法并稍做修改。取1 mL0.05 mol/L硼酸盐缓冲液(pH=8.2),30 μL 10 mg/mL EDC和30 μL 10 mg/mL NHS,涡旋混匀,加10 μL彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球,混匀,超声10 s,孵育30 min。孵育完,13 000 r/min离心15 min,弃上清,1 mL硼酸盐缓冲液重悬,超声10 s,加4 μL 1 mg/mL FITC抗体,涡旋混匀,孵育2 h后,加100 μL BSA封闭1 h。封闭完,13 000 r/min离心15 min,弃上清,100 μL BSA重悬,即偶联完成。

1.6 PCR扩增及电泳检测

PCR扩增体系为25 μL,该体系含有1 μL DNA提取物、10 mmol/L 10×Buffer、待优化的上下游引物、0.2 mmol/L的dNTP、待优化的MgCl2和1 U Taq DNA聚合酶。样品在PCR仪(Bio-Rad)中进行扩增,扩增条件为95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,在待优化的退火温度下退火30 s,72 ℃延伸30 s,3个循环,最终72 ℃延伸5 min。在相同条件下用水代替提取的模板DNA作为阴性对照。以1×TBE为缓冲液,4S Red plus为核酸染料,经3%琼脂糖电泳鉴定。

1.7 试纸条组装和检测过程

LFS由5部分组成,包括装载样品溶液的样品垫、装载偶联了FITC抗体的乳胶微球结合垫、固定识别分子的硝酸纤维素膜、吸水垫和支撑所有组件的支撑卡。抗FITC抗体的二抗和SAV分别固定在NC膜上作为豌豆检测的控制线(T线)和检测线(C线)。用含有0.05 mol/L Tris HCl(pH=8.0)、0.15 mol/L NaCl和0.25% Triton X-100的缓冲液使样品垫饱和。用含有0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)、5%蔗糖、1%海藻糖、0.3%吐温20和0.25%PEG-20000的缓冲液预处理结合垫。此外,将5 μL制备的偶联FITC抗体乳胶微球滴加在结合垫上。所有处理过的组分在37 ℃下干燥2 h。LFS检测过程是将5 μL PCR扩增产物和30 μL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)预混合,然后直接滴加在试纸条上的样品垫,5～10 min后观察T线和C线显色情况。

2 实验结果与分析

2.1 实验检测原理

本实验的操作过程及原理如图1所示。简单地说,通过磁珠法提取各豆类的DNA,加入Biotin和FITC分别修饰上游引物和下游引物,常规PCR扩增得到Biotin和FITC双修饰的目标产物,然后经过试纸条检测。试纸条检测过程中,当有目标产物时,产物一端FITC与结合垫上乳胶微球偶联的FITC抗体通过抗原抗体识别,而另一端Biotin被T线上SAV捕获从而显色,未结合的乳胶微球被C线上的二抗捕获显色;相应地,当没有目标产物时,T线不会显色,而C线上二抗会捕获未结合的乳胶微球上的抗体而显色。

图1 实验检测原理

2.2 引物设计与可行性验证

引物设计是实验的关键,设计过程中要考虑引物的特异性,若出现非特异性扩增,则试纸条会出现假阳结果。此外,加工过程中DNA完整性会被破坏,因此选取的扩增片段尽量要短。本实验引物设计过程中,首先通过美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)找到豌豆MEY基因差异序列,然后使用Primer5软件设计得到本实验所用的引物,引物序列见表1所列。该引物通过基于局部比对算法的搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)检索,只能扩增出豌豆MEY基因,扩增片段大小为101 bp,符合实验要求。此外,电泳和试纸条的预实验结果也表明该引物的可行性。

表1 引物序列

2.3 PCR的优化分析

因为本实验采用PCR和LFS相结合的方法,需要考虑PCR的扩增效率和非特异性扩增,扩增效率影响检测的灵敏度,非特异性扩增特别是引物二聚体会导致试纸条出现假阳,所以需要对PCR条件进行优化。影响PCR条件包括模板量、退火温度、dNTP、引物、循环数和镁离子等,本研究就退火温度、引物量和镁离子3个重要因素进行优化,结果如图2所示。

退火温度是PCR的关键因素,直接影响引物的结合效率,温度过高引物结合效率低甚至无法结合,过低结合特异性低[16]。图2a中:M代表M-500 bp DNA Marker;1～8分别代表退火温度为55.0、56.0、57.3、59.0、61.3、63.1、64.3、65.0 ℃。由图2a可知:泳道1～4条带亮度几乎相同;从泳道4(59.0 ℃)后,条带逐渐变暗,扩增效率逐渐降低;泳道6(63.1 ℃)以后没有目标条带;空白对照组也未出现引物二聚体。因此选取退火温度为59.0 ℃进行镁离子优化分析。

图2 PCR条件的优化结果

镁离子是Taq DNA聚合酶发挥作用的活性中心,镁离子浓度的高低会影响酶的活性,进而影响反应的扩增效果。图2b中:M代表M-500 bp DNA Marker;1～7分别代表镁离子浓度为1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 mmol/L。由图2b可知,泳道1～7均在101 bp附近出现唯一的目标条带,泳道1条带亮度较低,泳道2(1.75 mmol/L)以后条带亮度几乎一样,因此选取镁离子浓度为1.75 mmol/L进行引物优化分析。

引物量是PCR另一个重要因素,过低影响扩增效率,过高影响特异性。图2c中:M代表M-500 bp DNA Marker;1～7分别代表修饰引物浓度为0.02、0.04、0.08、0.12、0.20、0.30、0.40 μmol/L。由图2c可知,泳道1～7均在101 bp附近出现唯一的目标条带,且1～5条带亮度随引物浓度的增加条带越亮,泳道5(0.20 μmol/L)条带达到最亮,泳道6和7条带亮度不再增加,说明最佳修饰引物加入量为0.20 μmol/L。

2.4 特异性检测结果

特异性是实际应用的关键,本文选取8种常见的豆类,这些豆类在绿豆加工过程中经常会涉及到,因此适合用来作特异性分析。针对豌豆特异性检测,本文利用上述优化好的条件进行PCR扩增,最后通过LFS检测,结果如图3所示。图3中，试线条1～8分别代表豌豆、大豆、绿豆、黑豆、红豆、蚕豆、芸豆、鹰嘴豆，由图3可知,只有试纸条1(豌豆)T线呈阳性结果,其他试纸条均为阴性,灰度扫描图也相对应。这表明该测定方法对目标物种具有高度特异性,不会导致其他物种的错误识别。

图3 特异性检测结果

2.5 灵敏度检测结果

为了进一步检测PCR-LFS方法的灵敏度,将提取质量浓度为120 ng/μL豌豆DNA模板进行倍比稀释,依次稀释为原来模板的1/10、1/100、1/1 000、1/10 000、1/100 000,各取1 μL模板进行检测,检测结果如图4所示。

图4 灵敏度检测结果

图4中,试纸条1～7对应加入豌豆DNA的量为120、12、1.2、0.12、0.012、0.001 2、0 ng,结果显示试纸条1～4检测线都显色,且显色颜色逐渐降低,5～7没有显线,灰度扫描图也相对应,说明本实验方法的最低检测线为0.12 ng。

2.6 样品掺假检测结果

考虑本实验方法的实际应用效果,模拟了绿豆中豌豆掺假的过程,将豌豆粉按照质量分数10.0%～0%掺入到绿豆粉中,混匀,取50 mg掺假样本提取DNA,用建立的PCR-LFS方法检测,检测结果如图5所示。图5中，试线条1～9分别对应的豌豆粉质量分数为100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%，从图5可以看出，试纸条1～6的T线显色,且颜色逐渐变浅,试纸条6(0.5%)以后不显色,灰度扫描图也相对应,说明最低可检测的样品掺假量为0.5%。考虑到实际掺假情况,商家为自身利益掺假豌豆量一般高于1.0%,因此本方法最低0.5%掺假可检测结果完全满足实际的检测要求。

图5 掺假检测结果

3 结 论

本文以豌豆特异性基因为基础,采用PCR-LFS检测技术,建立一种快速、简便的掺假豌豆成分检测方法。实验设计了豌豆的特异性引物序列,并验证了引物的可行性,为了保证PCR的扩增效率和特异性,分别对退火温度、修饰引物浓度和镁离子浓度进行优化,最后进行LFS检测。该方法既拥有PCR特异性强、灵敏度高的特点,又具有LFS的快速、简便的优势,有利于简化操作步骤,缩短检测时间,保护实验人员的安全。此外,只需要改变特异性引物和扩增条件,就能对其他豆类品种进行鉴定,在物种认证和追溯性方面具有广泛的应用价值。