高原荨麻总黄酮提取工艺及含量分析*

黄国梁 宗和坤 左昆明 韩兴昊

（西藏农牧学院公共教学部，西藏 林芝 860000）

高原荨麻，为高寒地带植物，耐寒、耐瘠，抗逆性强，一般生长在海拔4200～5000m，但也有部分分布在2000m左右，多产于西藏雅鲁藏布江沿岸，四川、新疆、青海等地也有分布。其为一年生、多年生野本植物，自然生长在草丛和原始森林中。高原荨麻生长条件较为苛刻，低海拔植株生长较为分散［1］。现代药理学表明该植物含有黄酮类、木质素类、香豆素类等有效成分，具有很好的抗炎止痛、皮肤瘙痒、抗风湿等药理活性。荨麻在世界上广泛分布，与艾麻属（Laportea Gandich）有相似亲缘关系［2］，是我国常用的民间用药［3，4］，其含有丰富的脂肪、蛋白质、维生素C 等营养物质，并且在多个少数民族中作为猪饲料广泛使用［5］，裂叶荨麻中的汞、铅含量均未超过蔬菜的卫生限量标准，属于可食安全范围［6］，可列入保健食品资源之一［7］。国内外对荨麻属植物化学成分进行了大量的研究，结果表明该植物含有黄酮类、甾类、香豆素、木脂素、有机酸等成分［8-10］，具有抑制良性前列腺增生、抗风湿、降血糖、镇痛、抗炎、抗菌、抗氧化等药理活性［11-13］，临床主要用于良性前列腺增生、风湿、类风湿关节炎等疾病的治疗，疗效显著［14-16］。迄今为止有关高原荨麻中总黄酮含量的提取报道较少［17，18］。文章以高原荨麻为原料，芦丁含量为指标通过单因素及正交实验选择高原荨麻中总黄酮提取工艺，为研发药物等提供参考。

1 材料和药品

1.1 材料

高原荨麻（由西藏林芝市特产店提供）、四川荨麻，洗净后擦干，置于105℃下杀青，之后置于70℃下干燥，粉碎备用。

1.2 仪器

岛津LC-20A 高效液相仪、岛津UV-2700 紫外分光光度计、水浴恒温锅、恒温烘箱、优普超纯水机、分析天平。

1.3 试剂

芦丁标准品、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、乙醇、等均为AR分析纯，甲醇（色谱纯），实验用水均为用去离子水。

2 实验部分

2.1 芦丁显色剂的选用

结果表明当采用5%亚硝酸钠、10%硝酸铝、4%氢氧化钠做显色剂使用时显色效果最佳，但由于显色稳定性较差，固应现配现用［19］。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取105℃干燥至恒重的芦丁试剂标准品10mg，加入70%乙醇溶解，定容至100mL容量瓶中，摇匀，称作标样0，备用。

2.3 最大吸收峰的测定

吸取2.2 中的对照溶液0.00mL、2.5mL 置于10mL具塞量筒，加入70%乙醇溶液至5mL，之后加入5%亚硝酸钠0.3mL，放置6min 再加入10% 硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min，之后加入4%氢氧化钠4mL，之后用水稀释至10mL，放置15～20min 显色。之后以0.00mL 为空白，利用紫外分光光度计测量400～800nm的吸收曲线，确定当波长为415nm 时有最大吸收峰，固选用415nm处测定芦丁标准曲线。

2.4 芦丁标准曲线的测定

用移液枪吸取2.2 中的待测液，各加70%乙醇至5mL，转移至10mL 容量瓶并编号，之后加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min，再加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加4%氢氧化钠4mL，再用水稀释至10mL，放置15～20min。待显色完毕后，吸取1.5mL 待测液过0.45μm 微孔滤膜后，进行液相分析，得到线性回归方程y=584.27x+1742.8，R²=0.9990，如图1。

图1 芦丁标准曲线

2.5 色谱条件

流动相为甲醇－0.4%磷酸水溶液（55∶45）；柱温25℃；检测波长415 nm；流速1.0mL/min；进样量20 μL。

2.6 提取工艺优化

2.6.1 料液比对提取的影响。称取荨麻粉末1.00g 五份，放置在圆底烧瓶中，分别加入70%的乙醇5mL、10mL、15mL、20mL、25mL，在65℃连续回流2h，之后放冷、抽滤之后，回收乙醇，得到不同料液比下的浓缩液，将浓缩液用石油醚脱脂3～5 次，回收石油醚并用多倍量的无水乙醇沉淀多糖及蛋白质成分，过滤后将浓缩液蒸发到10mL 时，转移进100mL 容量瓶中，再用70%乙醇定容，得到样品吸取0.2mL 待测液转移至10mL 容量瓶中，按2.4 中的方法和2.5 中的色谱条件进入液相测定，结果如表1。

表1 料液比对提取的影响

2.6.2 乙醇浓度对提取的影响。称取荨麻粉末1.00g五份，放置于圆底烧瓶中，分别加入60%、65%、70%、75%、80%的乙醇10mL 在65℃连续回流2h，之后放冷、抽滤之后，回收乙醇，得到不同料液比下的浓缩液，将浓缩液用石油醚脱脂3～5 次，回收石油醚并用多倍量的无水乙醇沉淀多糖及蛋白质成分，过滤后将浓缩液蒸发到4～7mL 时，转移进100mL 容量瓶中，再用70%乙醇定容，得到样品吸取0.2mL 待测液转移至10mL 容量瓶中，按2.4 中的方法和2.5 中的色谱条件进入液相测定,结果如表2。

2.6.3 提取温度对提取的影响。称取荨麻粉末1.00g五份，放置在圆底烧瓶中，分别加入70%的乙醇15mL，在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃连续回流2h，之后放冷、抽滤之后，回收乙醇，得到不同料液比下的浓缩液，将浓缩液用石油醚脱脂3～5次，回收石油醚并用多倍量的无水乙醇沉淀多糖及蛋白质成分，过滤后将浓缩液蒸发到4～7mL时，转移进100mL容量瓶中，再用70%乙醇定容，得到样品吸取0.2mL待测液转移至10mL容量瓶中，按2.4中的方法和2.5中的色谱条件进入液相测定，结果如表3。

表3 提取温度对提取的影响

2.6.4 提取时间对提取的影响。称取荨麻粉末1.00g五份，放置于圆底烧瓶中，分别加入70%乙醇10mL，在65℃水浴中分别加热回流1h、1.5h、2h、2.5h、3h 之后放冷、抽滤之后，回收乙醇，得到不同料液比下的浓缩液，将浓缩液用石油醚脱脂3～5 次，回收石油醚并用多倍量的无水乙醇沉淀多糖及蛋白质成分，过滤后将浓缩液蒸发到4～7mL 时，转移进100mL 容量瓶中，再用70%乙醇定容，得到样品吸取0.2mL 待测液转移至10mL 容量瓶中，按2.4 中的方法和2.5 中的色谱条件进入液相测定，结果如表4。

表4 提取时间对提取的影响

2.6.5 正交实验的设计。在单因素实验基础上，设计因素水平表，见表5，选择料液比、乙醇浓度、提取时间作为考察因素，每个因素选取3个水平，以芦丁含量为指标选取最佳工艺。

表5 正交实验设计

2.6.6 正交实验结果。高原荨麻中芦丁含量提取工艺优化3 因素4 水平正交实验结果与分析，见表6，由此可知最佳提取工艺是A2B3C2D2即当液料比为1：50，乙醇浓度为70%，浸提时间为2h。

表6 正交实验结果分析

3 高原荨麻及四川荨麻中黄酮含量的对比

3.1 UV法分析两种荨麻黄酮含量

3.1.1 紫外标准曲线的测定。准确吸取2.2 中的制备液0.00mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL 分别置于10mL 量筒中，各加30%乙醇至5mL，转移至10mL容量瓶并编号，之后加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min，再加入10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加4%氢氧化钠4mL，再用水稀释至10mL，放置15～20min。待显色完毕后，以0.00mL 为空白，测定其吸光度，如图2，得到线性回归方程y=10.5x -0.487,R2＝0.9950。

图2 吸光度的线性回归方程

3.1.2 紫外仪器精密度测定。取对照液1 份，在仪器参数中设置测定次数为5次，每次测量间隔为2s（空白不更改），重复测试后吸光度RSD为0.1%.

3.1.3 两种荨麻黄酮含量的对比。分别取1 号、2 号、3 号样品，平行称取3 次，按照2.6 方法进行提取、定容后，取1mL 待测液按照2.4 中的方法定容之后进入仪器测定其吸光度，每份样品平均测定3 次，取平均值，带入3.1.1中线性回归方程计算总黄酮量，结果为紫外分光光度计所测定的含量见表7。

表7 紫外分光光度法测定样品总黄酮含量的测定结果

3.2 HPLC法分析两种荨麻黄酮含量

采用相同方法处理溶液100μL，用70%乙醇定容至10mL 容量瓶，过0.45μm滤膜，上机测定，测量峰值带入2.4中线性回归方程计算浓度，HPLC所测定含量见表8。

表8 HPLC法测定样品总黄酮含量的测定结果

4 结果与讨论

本研究通过单因素及正交试验优化高原荨麻中总黄酮的提取工艺，当料液比1∶50，乙醇浓度为70%，浸提温度为60℃，浸提时间为2h 时，为最优提取工艺。通过对两种荨麻总黄酮含量的测定，结果显示：紫外分光光度法测定高原荨麻中总黄酮含量为3.39mg/g 相较于四川荨麻2.89mg/g 要高出17.30%.高效液相法测定高原荨麻中总黄酮含量为3.19mg/g相较于四川荨麻2.84mg/g要高出12.32%.

HPLC 测定高原荨麻结果相较紫外测定结果普遍偏低，这是由于显色剂使用碱性铝离子，其显色能力随时间推移得到减弱，显色效果在30～90min 内最为合适，由于液相测定所需一定时间分离后才能通过uv检测器显示色谱图，故测定结果较紫外结果偏低且稳定性较差，故若使用碱性硝酸铝作为芦丁显色剂时，在条件允许下，应选用紫外分光光度计测定其总黄酮含量，结果较为准确。若要使用液相色谱进行测定，应波长改为360nm［7］处增强稳定性。

芦丁为黄酮类化合物，具有广泛的药理活性和较低的毒性，是天然药物研究的热点之一。若芦丁不加显色剂，吸收峰在360nm［7］左右，若芦丁在弱碱性条件下与Al3+发生显色反应，则会红移至415nm 处，这与其他文献中510nm［19，20］波长不符，推测显色终点可能与温度有一定关系。

考虑到高原地区光照时间长，荨麻植株受光照面积相较于低海拔地区更为充足，这也许是其黄酮含量相较于低海拔地区荨麻中黄酮含量高的因素之一。