中医药靶向TLRs治疗中枢神经系统疾病研究进展

刘欣，邵卫，陈国华*

(1.湖北中医药大学中医临床学院，湖北 武汉 430065；2.武汉市第一医院，湖北 武汉 430000)

近年来越来越多的证据表明不同中枢神经系统疾病均涉及免疫炎症发病机制，从有菌的颅内感染性疾病到包括脑血管病、神经退行性疾病和神经自身免疫性疾病在内的无菌性脑炎症损伤，神经炎症成为其发生发展的重要病理基础[1]。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)作为模式识别受体中的重要一员，在中枢神经系统包括小胶质细胞、星形胶质细胞等在内的免疫细胞上均有表达，能够识别各种外源性和内源性分子，进一步介导神经炎症的产生[2]。特异性靶向TLRs可能是免疫炎症相关中枢神经系统疾病中调节神经炎症的一个重要策略。虽然目前已有研究者设计出针对不同TLRs信号通路的新分子，但大多局限于其他系统疾病，在中枢神经系统疾病仅有少数研究[3]。而中医药往往通过多途径、多靶点起效，在抗炎等方面能发挥重要作用，目前尚无关于这一主题的全面综述。我们以TLRs信号通路与不同中枢神经系统疾病的关系为切入点，对近些年来有关中医药通过干预TLRs信号通路治疗各种免疫炎症机制相关中枢神经系统疾病研究进展作一综述。

1 TLRs简述

TLRs是存在于哺乳动物中的果蝇Toll蛋白同源物，是一种I型跨膜蛋白，由3个具有特定作用的成分组成,即富含亮氨酸重复区胞外域、跨膜区和胞质内Toll白介素-1受体结构域(TIR结构域)。迄今为止已发现13种不同的TLRs，其中在人体免疫细胞和非免疫细胞的质膜上或核内体/溶菌酶中找到10种TLRs(TLR1-TLR10)，在小鼠中发现了12种TLRs(TLR1-TLR9,TLR11-TLR13)。TLRs能与细菌、细菌产物、病毒、鞭毛蛋白等病原相关分子模式，以及在细胞损伤和坏死时被释放的内源性配体(也称为损伤相关分子模式)结合引发先天性免疫应答，进一步在适应性免疫应答的激活中发挥关键作用[4]。而TLRs信号通路主要由胞内接头蛋白如髓样分化因子88(MyD88)、髓样分化因子88样衔接蛋白、诱导干扰素β包含TIRs结构域的接头分子(TRIF)和TRIF相关衔接分子等介导，可分为依赖MyD88和依赖TRIF两种通路。除了TLR3，其余TLRs主要通过MyD88依赖通路进行信号转导。MyD88介导的信号通路一般有3个方面功效：增加促炎细胞因子的产生，启动丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应，刺激干扰素调节因子激活[5]。

2 TLRs与脑血管病

2.1 TLRs与脑血管病的关系

脑血管病作为中枢神经系统中最常见的疾病,具有较高的发病、致残及致死率。不论是缺血性还是出血性脑血管病，其发生、发展过程均涉及炎症细胞侵袭聚集、细胞因子上调等，TLRs作为脑内激活先天免疫系统的重要介质，通过与缺血或出血时释放的内源性和外源性分子相互作用介导了神经炎症发生，进一步损伤脑组织，被认为是预防脑血管病继发性脑损伤的潜在靶点[6]。据文献报道TLRs家族中TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8或TLR9似乎均参与了缺血性或出血性脑卒中后的炎症损伤，其中TLR4在脑血管病脑损伤的病理发展过程中比其他TLRs更为重要[7]。Sara Palma-Tortosa等[8]分析发现TLR4的激活在小鼠缺血性卒中后可能通过增加基质细胞衍生因子1-α和脑源性神经营养因子表达来促进神经干细胞的增殖和迁移，进一步调节神经修复中风后脑损伤。Parada E等[9]研究表明TLR4/NF-κB信号通路在脑缺血再灌注(I/R)损伤的发展过程中被明显激活，而抑制TLR4激活则能通过减少神经炎症相关因子的产生发挥神经保护作用。而另有研究发现不同的TLR4拮抗剂可保护脑I/R损伤或蛛网膜下腔出血小鼠模型的大脑，TLR4可能是改善缺血性或出血性卒中的有效靶点[10-11]。因此TLRs与脑血管的发生发展密切相关。

2.2 中医药干预TLRs治疗脑血管病

中药单药或其提取出的有效活性成分，可靶向TLRs改善缺血性或出血性脑血管病炎症反应的发生。研究发现丹参和川芎联合用药可能通过减轻参与动脉粥样硬化以及相关脑血管损伤的巨噬细胞和内皮细胞中TLR1/2、TLR3和TLR4激活的炎症反应来治疗动脉粥样硬化相关的脑血管疾病[12]。另有研究[13]发现姜黄素干预能明显降低永久性大脑中动脉闭塞大鼠模型神经功能缺损评分、脑梗死面积、神经元损伤、脑含水量和髓过氧化物酶活性，且抑制了大鼠脑内TLR2/4的表达，降低NF-κB p65的表达及血液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)的释放，说明姜黄素可能通过抑制TLR2/4-NF-κB信号通路发挥抗炎作用来保护脑缺血的神经损伤。Xue Lai等[14]研究发现肉苁蓉提取物毛蕊花糖苷能改善急性脑出血模型小鼠的行为评分，减少继发性脑损伤如血肿体积、脑水肿和神经元凋亡，然而体内和体外TLR4的敲除都能消除毛蕊花糖苷的上述作用，因此TLR4可能介导了毛蕊花糖苷发挥的神经保护作用。同样，其他研究者发现β-广藿香烯、银杏二萜内酯、五味子苷B、丹参酚酸B、葛根素等其他中药活性成分均可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路来减轻脑I/R损伤模型鼠神经缺损评分和梗死面积，对其发挥神经保护作用[15-18]。

3 TLRs与阿尔兹海默病

3.1 TLRs与阿尔兹海默病的关系

阿尔茨海默病(AD)是老年人群中最常见的神经退行性疾病，主要表现为认知功能障碍，伴精神行为异常和日常生活能力障碍。然而近一个世纪的研究仍然未能明确AD的病因及发病机制，随着研究者发现AD的主要病理标志物β淀粉样蛋白(Aβ)沉积斑块周围有活化的小胶质细胞等聚集，AD患者及动物的脑内也发现了细胞因子、趋化因子等炎症指标明显升高，且流行病学研究提示接受抗炎药物长期治疗的AD患者显示出病程进展变缓的疗效，这些证据都表明神经炎症在AD的发生发展中占有重要地位[19]。进一步的研究发现在AD脑内先天免疫细胞通过包括TLRs在内的各种先天免疫受体识别Aβ斑块，从而介导了神经炎症的发生[20]。早期研究者已经发现AD患者死后大脑中老年斑周围的小胶质细胞中TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9和TLRs共受体CD14的表达增加[21]。Zhang Wei等[22]发现AD患者外周血单核细胞TLR2表达增加，且TLR2水平与大脑功能呈负相关，因此认为血清TLR2水平有望成为AD的外周血标志物。近年来Walker等[23]研究发现人类AD大脑中与Aβ斑块相关的小胶质细胞中TLR3表达增加。至于TLRs在AD中的具体作用，目前研究最多的主要是TLR2、TLR4和TLR9，其中TLR2与TLR4均介导双重作用，即在AD的病理过程中表现出促炎和抗炎两种作用，有研究者考虑与AD处于疾病不同阶段有关来解释这一争议，即在AD的初始阶段TLR2/4发挥抗炎作用，介导Aβ的清除，而在AD的后期阶段，慢性刺激下TLR2/4则发挥促炎作用，加剧Aβ的沉积；TLR9则主要起到神经保护作用[24]。

3.2 中医药干预TLRs治疗阿尔兹海默病

中医药在以TLRs为靶点来干预AD方面也有相应的研究。Wang Xuerui 等[25]发现使用含有16种中草药的脑心通胶囊干预能改善APP/PS1小鼠认知行为学障碍，同时降低脑内磷酸化微管相关蛋白和Aβ积累，并抑制神经元萎缩和凋亡，进一步的机制研究发现脑内TLR4及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB均下降，因此脑心通胶囊可能通过抑制TLR4/NF-κB/IL-1β信号通路来对AD发挥神经保护作用。Qi Yue 等[26]研究发现文冠果壳苷能改善Aβ1-42诱导小鼠的空间损伤，并抑制小鼠海马中胶质细胞活化标志物及炎性因子的过表达，降低海马TLR2mRNA水平，阻断NF-κB p50和p65易位进入细胞核和细胞外信号调节激酶的磷酸化,且降低了氨基端激酶的表达，说明文冠果壳苷改善学习和记忆障碍可能与下调TLR2及下游信号通路中MAPK和NF-κB介导的炎性反应有关。Zhou Zhangjiuzhi等[27]通过对6～7个月的APP/PS1小鼠给予90d的杜仲树皮提取物京尼平苷酸干预，发现其改善了APP/PS1小鼠的学习和记忆功能，并减轻了Aβ斑块沉积及神经炎症，潜在机制可能是其在抑制胶质细胞活化而减少高迁移率族蛋白(HMGB-1)表达的情况下阻断了反应性小胶质细胞的TLR2-MyD88信号通路。

4 TLRs与帕金森病

4.1 TLRs与帕金森病的关系

帕金森病(PD)是第二类最常见的神经系统退行性疾病，其典型病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元丢失及α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集的路易小体形成。虽然PD的病因仍不清楚，越来越多的证据表明大量酶和受体参与的神经炎症与PD的发生发展密切相关，其中TLRs介导的内源性积累的α-synuclein诱导的小胶质细胞激活及炎症反应在PD中起重要作用[28]。Drouin-Ouellet J等[29]研究发现TLR2和TLR4在PD患者及小鼠模型血液和大脑中的表达水平明显升高。王国辉等[30]通过临床研究发现PD患者血浆HMGB-1、TLR4和NF-kB水平与健康人群相比明显升高，且与PD临床分期呈正相关，可能成为未来判断PD发病和分期的生物标志物。此外随着全基因组测序的开展，Zhao J等[31]研究发现汉族人群携带的TLR4基因可能增加其罹患PD的可能性。除了TLRs及其信号通路相关分子在PD中表达有差异外，研究者也通过TLRs特异性抗体的拮抗或基因的沉默进一步证明了TLRs与PD密切相关。谷有全等[32]研究发现使用TLR4单克隆抗体干预的1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)诱导的PD模型小鼠与模型组相比，其TLR4阳性细胞及CD11b阳性小胶质细胞数量明显降低，小鼠中脑TLR4、TNF-α及IL-1βmRNA均降低，从而说明了TLR4及小胶质细胞可能介导了PD神经炎症的发生。Conte Carmela等[33]研究发现，TLR4基因缺陷小鼠相比于野生型小鼠难以被MPTP诱导发生PD相关运动障碍及病理特点。Michela Campolo等[34]研究发现TLR7/8在MPTP诱导的PD小鼠模型中明显升高，且与PD模型组相比，TLR7/8基因缺失改善了PD小鼠的行为障碍，并减少了小胶质细胞和星形胶质细胞的激活及炎性因子的表达，说明通过拮抗TLR7和TLR8可能成为治疗帕金森病的一个潜在靶点。

4.2 中医药干预TLRs治疗帕金森病

中医药干预TLRs治疗PD也有较多研究。谌盈帆等[35]使用补肾活血方干预腹腔注射MPTP法构建的PD模型小鼠发现，与模型组比较中药组小鼠在爬杆试验和Morris水迷宫试验中爬下时间减少，逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加，且小鼠酪氨酸羟化酶阳性神经元数目增加，TLR4、NF-kB p65、IL-6、TNF-α的表达均下调，因此补肾活血方可能通过抑制TLR4/NF-kB信号通路及其下游炎症因子来改善PD小鼠运动障碍。周甜甜等[36]基于“脑-肠轴”理论发现使用天麻中分离出来的新型联苄化合物20C干预明显减少了MPTP诱导的PD小鼠胃和小肠中聚集型、硝基化α-synuclein的含量及TLR4、p-p65、IL-1β水平，说明20C可能通过抑制TLR4/NF-κB p65通路减轻胃肠道炎症反应，继而降低胃肠道病理性α-synuclein的生成及其沿“脑-肠轴”向中枢神经系统的传播，从而对PD小鼠发挥保护作用。阴俊俊[37]通过免疫荧光染色发现银杏内酯B减少了PD细胞模型及小鼠模型的离子钙接头蛋白+TLR4+及胶质纤维酸性蛋白+TLR4+的表达,并降低了TNF-α表达，因此银杏内酯B可能通过抑制神经胶质细胞活化及TLR4介导的相关炎症因子表达来保护PD黑质多巴胺能神经元。孙莹[38]研究发现虫草素可能通过抑制TLR4/NF-KB/NLRP3信号通路的激活来抑制脂多糖诱导的PD模型神经炎症和细胞焦亡,从而对多巴胺能神经元发挥保护作用。Jing Yang等[39]研究发现黄芪提取物毛蕊异黄酮可能通过抑制TLR2/4-NF-κB通路和MAPK通路减轻PD小鼠行为功能障碍，同时抑制了多巴胺能神经元的丢失和小胶质细胞活化，改善了神经炎症反应。

5 TLRs与多发性硬化症

5.1 TLRs与多发性硬化症的关系

多发性硬化症(MS)是中枢神经系统自身免疫性疾病，以慢性炎症、脱髓鞘、轴突和中枢神经系统的神经元丧失为特征，其确切病因及发病机制仍未明，目前多认为免疫功能异常在其发病中起着关键性作用，而TLRs作为脑内先天免疫受体可能介导了多发性硬化症相关的炎症反应。S.B.Patten等[40]发现MS患者大脑中TLR2、TLR4和小胶质细胞增生的mRNA表达升高。Dalia Ahmed Labib等[41]采用流式细胞术检测发现与健康者相比，TLR2在MS患者淋巴细胞和中性粒细胞的表达显著升高，而TLR4仅在淋巴细胞的表达显著升高，且TLR-2和TLR-4的表达均有相应的敏感性和特异性。Pavan Bhargava等[42]比较了MS患者和健康者之间循环细胞外囊泡上的表面蛋白之间的差异，发现与健康者相比，TLR4浓度较高。上述研究为MS提供了潜在的生物标志物。研究者通过进一步研究发现了TLRs参与MS的潜在机制。Fletcher J M等[43]发现适应性免疫T辅助细胞Th17和Th1进入脑组织后能通过TLR4识别髓磷脂蛋白被激活，导致促炎细胞因子IL-6和IL-23的分泌而在MS中发挥致病作用。其他研究表明脑组织中的TLR配体通过细胞内信号转导激活TLRs，主要是TLR3和TLR4，引起炎症因子干扰素-γ(IFN-γ)和IL-17的分泌增加，直接导致MS的发生[44]。Ying Zhang等[45]发现TLR4缺失不仅难以构建实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(EAE)，而且抑制了EAE小鼠病变区域炎症因子和趋化因子CCL25的分泌，且Th17细胞中CCR9的表达减少，趋化迁移减弱，因此认为TLR4可能通过CCL25/CCR9信号介导Th17浸润来参与EAE发病。

5.2 中医药干预TLRs治疗多发性硬化症

部分西药的研究显示其可能通过抑制海马区TLR2/TLR3/TLR4介导的炎性因子的表达来改善MS小鼠的行为障碍及病理上脑组织髓鞘的丢失[46]，中医药也有相应的研究。Abdin等[47]使用雷公藤根中提取物雷公藤红素干预EAE小鼠发现其能降低其临床评分，且大脑中TLR2蛋白的表达明显降低。Kim Min ju 等[48]发现红豆活性提取物齐墩果酸醋酸能改善EAE小鼠后肢瘫痪及脊髓内炎症细胞浸润，并阻断EAE小鼠脊髓中TLR2及其下游促炎细胞因子的上调。因此雷公藤红素和齐墩果酸醋酸可能均通过抑制EAE中TLR2信号通路介导的神经炎症来起效。Alyria Teixeira Dias等[49]发现EAE小鼠脊髓中TLR3、TLR9水平较正常对照组降低，而使用槐角中提取出的活性成分染料异黄酮干预后增加了EAE小鼠脊髓中TLR3、TLR9、IFN-β表达，减少TH1、Th17细胞因子表达来延迟疾病的发作，并减少了脊髓中炎症浸润和脱髓鞘，说明染料异黄酮可能预防多发性硬化症的发生。李玥珺[50]研究发现通过二次免疫法建立的实验性自身免疫性脑脊髓炎模型大鼠相较于正常对照组脑组织中TLR2/TLR4表达增多，而温胆汤干预后可降低大鼠脑组织TLR2/TLR4的表达，并降低了细胞因子IL-2、IFN-α的表达，说明温胆汤改善EAE临床症状及病理改变可能与TLRs通路有关。何新新等[51]发现肉桂的主要成分肉桂醛可抑制TLRs的活性，具有显著的抗炎作用，在MS的治疗中发挥积极作用。

6 展望

脑血管病、AD、PD、MS虽然属于不同的中枢神经系统疾病，但却基于相同的免疫炎性病理基础，本文结合现有研究所探讨的TLRs与中枢神经系统疾病的联系主要表现在两个方面，其一是TLRs在中枢神经系统疾病中出现相对于健康者的血液或组织中差异表达；其二是通过使TLRs过表达或沉默的方法发现上述疾病临床症状和病理特征的改善或恶化来体现TLRs的潜在作用机制，从而说明了TLRs可能成为免疫炎症相关中枢神经系统疾病的有效干预靶点。进一步通过中药或其活性成分干预疾病细胞或动物模型来发现其靶向TLRs的潜在价值，为中医药干预TLRs治疗与免疫炎症相关中枢神经系统疾病提供了实验依据。虽然目前已开展基于神经炎症机制的流行病学研究、非甾体类抗炎药及其他抗炎药物治疗能降低神经系统疾病发生的风险,但其疗效和作用机制仍需要进行深入研究。而中药因其疗效明确，成分清晰，具有多环节、多靶点、多途径等作用特点，且不良反应较小，在治疗免疫炎症相关中枢神经系统疾病方面发挥着越来越大的作用，未来可以在中医药中开发以TLRs为靶点的激动剂或拮抗剂，或调节其下游信号通路，探讨全新的对抗神经炎症治疗手段。