低氧与免疫细胞※

李慧倩综述 永 胜审校

(青海大学医学部，青海 西宁 810016)

低氧可以触发免疫细胞中低氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)的表达并使之趋于稳定，同时HIFs作为免疫细胞功能的调节器影响免疫反应。阐明低氧在固有和适应性免疫中的作用是低氧与免疫研究方向备受关注的课题，相关研究已经衍生出许多新的观点和结论，但部分观点仍存有异议。本文主要就低氧在固有和适应性免疫细胞的调节中发挥的作用进行综述。

1 低氧对固有免疫细胞的影响

1.1 对中性粒细胞的影响

多项研究显示低氧影响中性粒细胞的脱颗粒反应。据报道，从急性缺氧的健康志愿者动脉血中分离的中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)释放(脱颗粒，在体外)增加[1]；研究发现与常氧条件相比，低氧条件下分离的人外周血中性粒细胞会释放更多的去甲肾上腺素、髓过氧化物酶和基质金属蛋白酶等颗粒物质，以增强抗菌作用[2，3]；Hoenderdos等发现[2，4]，低氧可以通过HIF非依赖途径增强中性粒细胞的脱颗粒反应。目前，低氧影响中性粒细胞脱颗粒研究的总体共识是低氧通过增加颗粒胞吐作用增强中性粒细胞的抗菌功能，中性粒细胞颗粒亚型的不同，会导致抗菌功能的不同。低氧增强中性粒细胞的脱颗粒反应是一把“双刃剑”，这种反应既能增强抗菌能力，又能在反应过程中释放有毒颗粒造成周围组织广泛损伤[5]。

此外，大量研究表明低氧对中性粒细胞的凋亡有重要影响。如曹洁等报道，中性粒细胞的凋亡在低氧环境下受到严重抑制，且HIF-1信号通路在持续低氧条件下是调节中性粒细胞凋亡的关键通路[6]。有研究发现，HIF-1α可以抑制中性粒细胞凋亡[7]。Thompson等人发现[8]，中性粒细胞中HIF-2α基因的特异性缺失会增加中性粒细胞在体内的凋亡数量。另外，体外培养实验结果显示，与常氧培养相比，低氧-常氧的培养条件延迟了中性粒细胞的凋亡[9]。目前，对低氧抑制中性粒细胞凋亡的机制研究集中在与HIF、NF-κB相关的通路上。

1.2 对巨噬细胞的影响

有研究认为，巨噬细胞根据其表型特征和生物学功能的不同通常可极化为两个亚群细胞，包括经典激活的巨噬细胞(M1)和替代激活的巨噬细胞(M2)[10]。低氧影响巨噬细胞的极化反应和效应功能。例如，有研究将从健康志愿者外周血中分离诱导获得的巨噬细胞置于常氧和低氧条件下培养，并采用流式细胞术检测M1、M2的表面标志物表达和细胞因子释放情况，发现低氧培养的M1细胞CD206的mRNA表达明显高于常氧培养的M1细胞，其细胞培养上清液中TNF-α、IL-12的分泌减少，而IL-1β的分泌增加；与常氧M2细胞相比，低氧M2细胞的CD80阳性细胞百分率显著降低，其细胞表面标志物CD206的表达水平显著升高，细胞培养上清液中TNF-α、CCL18(趋化因子-18)和CCL24的释放被缺氧所抑制，但IL-12与TGF-β的分泌未受影响[11]。上述研究结果提示，低氧环境阻碍巨噬细胞向经典激活表型极化，并促进一些替代激活表型的典型分泌特征的获得。Ke Xixian等人的研究得出了与此相似的结论：低氧可以影响巨噬细胞的极化，不同的是，低氧降低了M1细胞中促炎介质的分泌，对M2细胞的影响不明显[12]。众所周知，巨噬细胞适应低氧的过程涉及许多基因的表达，其中主要的基因是HIF-1。然而研究表明，在低氧通过调节巨噬细胞极化影响A549肺癌细胞恶性行为的调控过程中，参与调控的关键因子是p38蛋白，而不是HIF-1α[12]，这与Rodrigues等人的研究结论有出入[13，14]。Gondin等人的研究也发现，在无菌炎症模型中，敲除骨髓HIF-1或HIF-2对巨噬细胞的极化反应和效应器功能没有影响，提示HIF-1、HIF-2可能不是巨噬细胞极化的关键因子[15]。因此，以上研究提示低氧可以通过HIF依赖与非依赖途径影响巨噬细胞的极化反应和细胞因子分泌功能，但关于低氧如何调控巨噬细胞极化反应过程，参与调控此过程的关键分子及介导通路是哪些等问题，有待进一步探索。

另外，一些研究证明HIF-1α在巨噬细胞感染过程中发挥重要作用。Braverman等人发现[16]，HIF-1α缺乏的巨噬细胞在控制IFN-γ依赖的结核分枝杆菌感染时存在缺陷，而HIF-1α蛋白水平的升高有助于协调巨噬细胞向有氧糖酵解的代谢转移，以及大量免疫效应物质的产生，对于控制IFN-γ依赖的巨噬细胞感染至关重要。Knight等人证明，HIF-1α介导形成的IFN-γ依赖性巨噬细胞内脂肪滴，是巨噬细胞对结核分枝杆菌免疫反应的关键因素[17]。有研究观察到肺结核病的小鼠模型中巨噬细胞HIF-1α的表达水平升高，于是做了进一步的研究发现：在结核病早期，将HIF-1α阻断会导致小鼠疾病病情加剧；而在结核病晚期，抑制HIF-1α则会使巨噬细胞凋亡数量增加、细菌载量降低，提示HIF-1α在结核病的早晚期发挥着不同的作用。

此外，多数学者对于HIF-1α在利什曼原虫感染中发挥的保护性作用持一致结论。Mesquita等人证明[18]，HIF-1α的遗传缺陷能够导致骨髓细胞的抗利什曼原虫感染功能受损，巨噬细胞中敲除HIF-1α使巨噬细胞更容易感染利什曼原虫[14]。Alonso等在体外观察发现[19]，低氧增强了巨噬细胞对利什曼原虫感染的抵抗力。然而，部分学者对此持有不同意见：Singh等人认为[20]，利什曼原虫在受感染的巨噬细胞中因利用HIF-1获得细胞内生存优势而受益；Schatz等人认为[21，22]，单核吞噬细胞中的HIF-1α在利什曼原虫诱导的皮肤利什曼病中具有保护作用，而在内脏利什曼病中是有害因素，其稳定激活促进了脾脏和骨髓中利什曼病的发生。因此，在内脏和皮肤利什曼病中，使HIF-1α稳定的不同背景很可能影响HIF-1α激活的功能后果，需要进一步研究来揭示最终导致HIF-1α依赖性固有免疫细胞功能差异的不同信号。

1.3 对树突状细胞的影响

多项研究表明，低氧可促进树突状细胞(dendritic cells，DCs)的迁移和迁移能力。Kohler T等人发现[23]，暴露在低氧环境中的未成熟DCs以HIF-1α依赖的方式上调CCR7，而CCR7与其配体CCL21、CCL19的结合是控制DCs向引流淋巴结迁移的重要方式[24]；Irene Filippi等[25]通过单核细胞体外迁移实验发现，短期缺氧可增强人的单核细胞源性DCs的迁移能力。以上研究表明，低氧可以促进未成熟DCs的迁移能力。另外，有报道称DCs的糖酵解代谢重编程部分受到HIF-1α的调节，HIF-1α在低氧条件下稳定，可促进糖酵解基因的表达，糖酵解的增加对DCs向引流淋巴结的迁移至关重要[26-28]。然而，也有报道显示，低氧微环境可以通过抑制DCs膜表面膜1型金属蛋白酶(membrane type 1 metalloprotease，MT1-MMP)和MMP-9的产生抑制单核细胞衍生性DCs的迁移活性，从而减弱能够引起适度免疫反应的刺激[29]。以上结果表明，虽然低氧影响DCs迁移能力的研究已经得到了学术界的广泛关注，但缺乏共识，推测上述结果出现差异的原因可能与DCs的成熟程度及低氧刺激的时间长短有关。

此外，低氧可以影响DCs介导的T细胞反应。Akil Hammami等人认为[30]，在低氧和炎症的微环境中，HIF-1α的稳定表达抑制DCs产生IL-12，从而限制了Th1细胞的发育，并干扰慢性内脏利什曼病期间保护性Th1反应的启动和维护。缺失HIF-1α基因的DCs激活的T细胞释放颗粒酶B的水平显著降低，提示HIF-1α可以促进DCs介导的T细胞活化[31]。Flück K等人将敲除DCs特异性 HIF-1α基因的结肠炎小鼠模型与野生型小鼠同时暴露在低氧环境下饲养，发现DCs HIF-1α的缺失损伤了其对调节性T细胞(Tregs)的诱导，导致小鼠出现更严重的肠道炎症[32]。这些结果均表明HIF-1α的稳定存在有助于DCs介导的T细胞适应性免疫反应的发生。

2 低氧对适应性免疫细胞的影响

2.1 对B淋巴细胞的影响

低氧和HIFs在B细胞的发育和其他功能中起重要作用。B细胞在发育和分化过程中暴露于不同的氧水平。Cho等人证明，生发中心(Germinal center，GC)明区是缺氧的，这诱导了B细胞中HIF的表达[33]。最近的研究显示，HIF活性在骨髓B细胞的不同发育阶段有所不同。例如在人和小鼠骨髓祖B细胞和前B细胞中HIF活性较高，而在未成熟B细胞阶段活性较低，且HIF-1α活性异常与B细胞谱系多样性受限、B细胞受体(BCR)编辑和存活率降低均有关联，B细胞发育过程中低氧依赖基因的表达与糖酵解和细胞周期基因表达的增加也有关联[34，35]。这些结果表明HIF的活性变化对B细胞的正常发育十分重要。另外，Jellusova等人认为，在代谢适应过程中，GC B细胞分别通过HIF和糖原合成酶激酶3(GSK3)促进糖酵解和线粒体生物合成，以支持低氧微环境中B细胞的生长和增殖[36]。在脾脏和淋巴结的GC中，静止的B细胞受到抗原刺激后增殖、分化，产生高亲和力抗体，并促进抗体类别转换。通过敲除B细胞中的VHL来稳定HIF导致促炎性IgG2c亚型的成熟和类别转换受损，以及记忆B细胞和整体B细胞的形成减少[33]。Abbott等人得出了与之相反的结论，认为低氧条件下Ig的类别转换增加[37]。因此，以上研究表明缺氧和HIF之间存在复杂的关系，上述结果的出现可能受刺激的类型和低氧暴露时间长短的影响。

此外，Meng等人的研究证明了HIF-1α在驱动B细胞IL-10表达及控制其在炎症性疾病中的保护活性方面的关键作用[38]。Qian等人的研究也发现了HIF-1α诱导的B细胞CD11b分子的表达上调与B细胞在某些炎症性疾病中的保护作用有关[39，40]。因此，HIF-1α对B细胞介导的保护性抗炎反应具有重要作用，或许可以作为一些炎症性疾病的治疗靶点。

2.2 对T淋巴细胞的影响

目前，已有多项研究认为HIF-1α与Th17/调节性T(Treg)细胞的免疫平衡调节密切相关。有研究者发现，木香烃内酯通过抑制Th17细胞的糖酵解过程和分化程度降低Th17/Treg细胞的比例，从而减轻了溃疡性结肠炎(UC)的促炎损伤，此过程中，木香烃内酯对HIF-1α泛素化-蛋白酶体降解途径的触发是主要的分子机制[41]。有报道认为，芍药汤能够通过抑制HIF-1α的活化来调节Th17/Treg细胞的免疫平衡，从而改善UC大鼠的炎症反应[42]。也有研究表明，敲除骨髓细胞中的HIF-1α导致葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎的临床症状减轻，并且使Tregs的存活率增高；而敲除骨髓细胞中的HIF-2α导致由DSS诱导的小鼠结肠炎炎症反应加剧，且促炎因子IL-17的表达升高：提示HIF-1α与HIF-2α在DSS诱导的小鼠结肠炎中发挥的作用不同[43]。因此，上述研究结果提示，HIF-1参与了Th17/Treg细胞的发育及分化平衡调节，准确地说，T细胞中HIF-1的稳定维持可以促进Th17细胞的发育，抑制Treg的分化及其他功能。

有报道发表了与之相反的结论，Astrid M等人将从结肠炎相关性结肠癌小鼠模型的结肠固有层淋巴细胞中分离出的CD4+效应T细胞和Treg细胞，置于常氧和低氧条件下培养，并检查其表型和功能，结果发现小鼠结肠中严重缺氧，伴随着CD4+效应T细胞分化减少，Treg细胞数量和抑制活性增加；且体内外补充研究表明，低氧条件下的T细胞刺激抑制了Th1细胞的分化、增殖和IFN-γ的产生，并增强了Treg的抑制能力[44]。由此可见，HIF-1影响免疫细胞间功能平衡的深入机制尚待进一步探讨。此外，有研究发现哮喘患者体内高表达的甲基化CpG结合域蛋白2(MBD2)通过HIF-1α介导调节Th17细胞的分化，为中性粒细胞主导的炎性哮喘表观遗传调控提供了新的见解[45]。Ruifang Wu等人的实验结果表明，HIF-1α参与银屑病患者外周血单核细胞和CD4+T细胞中microRNA-210基因的转录激活调控，而microRNA-210的过表达能够促进Th1、Th17细胞的分化，抑制Th2细胞的分化，进而加重银屑病患者外周血与皮损中的免疫失衡和炎症反应[46]。

总之，通过以上研究能够得出下述结论：HIF-1α是参与调节免疫细胞间功能平衡的关键分子，并且与炎症性疾病的发展密不可分，或可成为多种炎症相关性疾病的治疗靶点。

此外，低氧在调节细胞毒性T(CD8+T)细胞功能中也起重要作用。实验发现，低氧以HIF-1α依赖的方式影响CD8+T细胞的糖酵解代谢，缺乏HIF-1α的CD8+T细胞显示糖酵解代谢相关基因的表达受损，同时，研究证明HIF-1α的缺失导致终末分化的CD8+T细胞存活率降低，其产生效应细胞因子TNF-α和IFN-γ的数量也降低[47]。Yael Gropper等人的研究得出了相似的结论，低氧条件下CD8+T细胞的存活和成熟良好，效应产物颗粒酶B的产量更高，溶细胞能力更强，且与糖酵解相关的基因表达水平更高[48]。另外，Liikanen等人的实验结果表明CD8+T细胞中HIF的激活促进了CD8+T细胞在肿瘤组织中的驻留、积累及其抗肿瘤能力，为过继性T细胞疗法在癌症治疗中的应用提供了新的参考依据[49]。总之，以上研究表明低氧对CD8+T细胞的功能具有增强作用。

然而，也有一些学者发表了相反的观点。Multhoff G等认为，低氧通过降低CD4+、CD8+T细胞等效应细胞的生存能力、溶细胞毒性和迁移活性，负向调节机体的抗肿瘤免疫反应[50]。Charles等人发现DCs中HIF-1α的条件性缺失增强了它们诱导CD8+T细胞反应的能力，而表达HIF-1α的DCs则表现出驱动效应CD8+T细胞功能的能力降低，产生的抗炎介质增加[51]。

目前，关于低氧影响CD8+T细胞功能的具体机制尚不明了，出现上述两种不同的观点，可能与CD8+T细胞的分化状态及激活环境有关。进一步探讨低氧及HIFs参与增强或抑制CD8+T细胞效应功能的深层机制，将为肿瘤及炎症等相关疾病的治疗提供新的思路。

3 结语

低氧影响免疫细胞功能的各个方面，在固有免疫和适应性免疫调节过程中发挥重要作用。目前，尽管多数关于低氧和HIFs与免疫细胞的研究仍处于初步探索阶段，且部分结论尚存有差异，但随着生物信息学的快速发展及分子实验技术的不断进步，相信低氧和HIFs调控免疫细胞功能的深层作用机理将逐步得到阐明，且HIFs在不同的免疫细胞类型和不同的环境中表现出的功能差异，将使其成为一个具有挑战性的疾病治疗靶点。