褪黑素预处理对老年大鼠骨骼肌缺血再灌注后认知功能的影响

李琳 夏洪莲 张月顺 胡春阳 崔晓爽 芦相玉

牡丹江医学院附属红旗医院麻醉科，黑龙江牡丹江 157011

褪黑素在牛的松果体中提取，其能分泌一种具有神经内分泌活性的物质，进入血液中，参与血液循环，从而对身体各器官和组织细胞发挥对应的作用。目前许多研究证实，褪黑素可以参与许多生物调节过程，如节律性、免疫、神经内分泌调节，甚至用于肿瘤的防治、催眠镇痛、清除自由基及延缓衰老等[1-4]。术后认知功能障碍（post operative cognitive dysfunction，POCD）是指术后记忆力、学习力、认知力等功能受到一过性甚至永久性损伤，致使社会活动能力减退[5]。但POCD 发生机制尚未完全明确，目前对POCD 的发生机制主要倾向于应激、创伤所引起的炎性反应，多数认为血清中肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的释放与POCD的产生密切相关[6,7]，因褪黑素与免疫、内分泌调节和清除自由基功能有关[8,9]，故本实验旨在探讨褪黑素是否可以通过免疫调节来降低 POCD 的发生，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

褪黑素（西亚化学科技有限公司），Rat IL-6 ELISA 试剂盒（欣博盛生物科技有限公司），DW-2000 型小型动物呼吸机（上海嘉鹏科技有限公司）、Morris 水迷宫视频分析系统（北京众实迪创科技发展有限公司）、低温冰箱（SANYO MDF-436）。

1.2 实验动物

选择健康雄性老年大鼠64 只（24 月龄，体质量300～350g），饲养环境22～26℃，湿度40%～47%，无声、光等刺激，充足食物及水分供应，光照时间12h，黑暗循环，64 只大鼠均按清洁级标准饲养，由牡丹江医学院动物实验中心提供，实验动物许可证号：SYXK（黑）2019-006。大鼠来源于SPF 级动物房，黑白周期各为12h，自由摄食饮水。经牡丹江医学院红旗医院伦理委员会许可，操作符合实验动物伦理学要求。

1.3 实验分组

采用随机数字表法分4 组，每组16 只（n=16），分为空白组（blank group，B 组）、对照组（control group，C 组）、氯化钠组（sodium chloride group，NS 组）和褪黑素组（melatonin group，MT 组）。

1.4 模型制备

根据Murata等[10]缺血再灌注模型制备方法加以利用改进，予5%戊巴比妥钠溶液，以50mg/kg 剂量腹腔注射诱导麻醉，实验过程中使用加温毯，将体温保持37℃。为了压缩双侧后肢，根据Murata等[10]的修改方法，将Rosenthal13 用于小鼠的卡式止血带制备一对橡胶止血带。在金属圆筒（外径22mm、内径20mm、长70mm）上缠绕5 圈，承受重量2kg，施加宽2.4cm、厚1mm 的橡胶止血带。将大鼠腹面向上举起，其脚通过金属圆筒落下。通过将止血带推到大鼠大腿上来诱导后肢压迫一段时间后，通过切割和取下止血带解除压迫。止血带拉力等同于3kg 重物的压力，5h 后撤除止血夹恢复挤压肢体血流灌注，其间大鼠能自由获取食物与水。

1.5 药物干预

空白组（B 组）除腹腔予5% 戊巴比妥钠（上海上药新亚药业有限公司，生产批号：国药准字：H31020240）麻醉外无任何处理、对照组（C 组）挤压肢体前无药物干预、氯化钠组（NS 组）挤压肢体前30min 予10ml/kg 生理盐水和褪黑素组（MT 组）挤压肢体前30min 予10ml/kg 褪黑素溶液，给药方式均通过大鼠尾静脉5min 内推注。

1.6 水迷宫实验测试

水迷宫实验测试即学习记忆功能测试，于术前、术后1～5d 测试，时间定为每天上午9 点，根据测定方法进行[11]，测试仪自动得出逃避潜伏期、跨越平台次数以及目标象限停留时间百分比。

1.7 TNF-α、IL-10 水平检测

术前、术后1d、3d、5d 采集尾静脉血1ml，采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定TNF-α、IL-10 水平。

1.8 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件对数据进行处理分析，多组间比较采用重复测量设计的方差分析，计量资料以均数±标准差（）表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 定位航行实验结果

4 组大鼠实验过程中均无死亡，均未见麻醉相关并发症发生。4 组游泳速度比较，差异无统计学意义，说明无疼痛等干扰水迷宫测试结果。

通过方差分析定位航行实验结果显示，随着时间的推移，各组潜伏期逐渐缩短，说明认知能力逐渐恢复中。除空白组及褪黑素组术后5d 外，与术前1d 比较，其他5 个时点潜伏期均显著延长（P＜0.05），与空白组比较，其他3 组潜伏期显著延长（P＜0.05），与对照组比较，褪黑素组的潜伏期显著缩短（P＜0.05），与氯化钠组比较，褪黑素组的潜伏期显著缩短（P＜0.05），见表1。

表1 各组潜伏期比较（）

表1 各组潜伏期比较（）

注：与术前1d 比较，*P＜0.001；与B 组比较，#P＜0.001；与C 组比较，ΔP＜0.05；与NS 组比较，▲P＜0.05

2.2 空间探索实验结果

定位航行实验包括目标象限停留时间百分比和穿越平台次数，通过记录120s 内在目标象限探索时间和准确穿越平台的次数，算出目标象限停留时间百分比，其反映实验对象的记忆功能。百分比越低，穿越平台次数越少，记忆功能越差。第6 天空间探索实验轨迹直观地显示了大鼠的穿越平台次数和目标象限（第3 象限）停留时间，见表2、表3。

与空白组比较，对照组和氯化钠组穿越平台次数显著减少（P＜0.001），与对照组比较，褪黑素组穿越平台次数显著增加（P＜0.01），与氯化钠组比较，褪黑素组穿越平台次数显著增加（P＜0.05），见表2。

表2 穿越平台次数与目标象限停留时间百分比（）

表2 穿越平台次数与目标象限停留时间百分比（）

注：与B 组比较，*P ＜0.001；与C 组比较，#P ＜0.05，与NS 组比较，ΔP＜0.05

与空白组比较，对照组和氯化钠组目标象限停留时间百分比显著减少（P＜0.001），与对照组比较，褪黑素组目标象限停留时间百分比显著增加（P＜0.01），与氯化钠组比较，褪黑素组目标象限停留时间百分比显著增加（P＜0.01），见表2。

与B 组比较，MT 组趋向性较好，两组差异无统计学意义，C 组和NS 组相对穿越平台次数和目标象限停留时间较B 组和MT 组少。

2.3 炎症因子水平

2.3.1 血清IL-10 水平的变化 与术前1d 比较，对照组、氯化钠组、褪黑素组术后1、3、5d IL-10 水平显著升高（P＜0.05）；与空白组比较，其他3 组术后1、3、5d IL-10 水平显著升高（P＜0.001）；与对照组比较，褪黑素组IL-10 水平显著降低（P＜0.05）；与氯化钠组比较，褪黑素组IL-10 水平显著降低（P＜0.05），见表3。

表3 大鼠各时点血清IL-10 水平比较（，pg/ml）

表3 大鼠各时点血清IL-10 水平比较（，pg/ml）

注：与术前1d 比较，*P＜0.05；与B 组比较，#P＜0.001；与C 组比较，ΔP＜0.05；与NS 组比较，▲P＜0.05

2.3.2 血清TNF-α 水平的变化 与术前1d 比较，对照组、氯化钠组、褪黑素组术后1、3、5d TNF-α 水平显著升高（P＜0.05）；与空白组比较，其他3 组术后1、3、5d TNF-α 水平显著升高（P＜0.001）；与对照组比较，褪黑素组 TNF-α 水平显著降低（P＜0.05）；与氯化钠组比较，褪黑素组TNF-α 水平显著降低（P＜0.05），见表4。

表4 大鼠各时点TNF-α 水平比较（，pg/ml）

表4 大鼠各时点TNF-α 水平比较（，pg/ml）

注：与术前1d 比较，*P＜0.001；与B 组比较，#P＜0.001；与C 组比较，ΔP＜0.05；与NS 组比较，▲P＜0.05

3 讨论

POCD 的发病机制目前尚未完全阐明，但研究证实，炎症因子可以影响POCD 的发生[11]。雌激素具有抗炎作用，缺血再灌注、麻醉和应激反应引起围术期非特异性炎性反应，POCD 患者血浆IL-6、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、TNF-α 等水平均高于未发生POCD 的水平[12]。

本研究对老年大鼠骨骼肌进行缺血再灌注造模[7]，此种造模引起炎症相关细胞的激活和机体炎性反应状态对中枢神经系统产生多重影响，导致神经功能和神经胶质平衡的变化[13,14]。缺血再灌注与外周器官组织损伤引起神经炎症造成海马区受损，是围术期老年患者认知障碍的关键因素[15]。本实验选择水迷宫测试大鼠空间探索来检测其认知功能，首先术前排除不会游泳的老年大鼠，着重从行为学、炎症介质变化等方面进行观察。本研究选择褪黑素，因其具有抗氧化、抗炎活性[16-17]，近年来，褪黑素在缺血再灌注损伤相关实验中广泛应用，其具有对缺血再灌注局部及远隔器官损伤的保护作用[18,19]。多数学者认为，褪黑素的这种保护作用与抑制氧自由基释放、中性粒细胞的激活及炎性细胞因子的大量释放密切相关，进而保护远隔器官[20]。同时，缺血再灌注诱发全身炎性反应，可以导致神经元损伤进而出现认知功能的减退，故认为褪黑素可以通过抑制炎性反应，抑制氧自由基的释放，减轻神经元的损伤从而降低认知功能障碍的发生率。

本研究发现，术后采用Morris 水迷宫实验测试大鼠学习记忆能力，结果表明，4 组大鼠术后的游泳速度无显著差异（游泳速度是用来评判疼痛程度及运动功能障碍引起的潜伏期改变），表明术后疼痛没有干扰水迷宫的测试结果。与空白组比较，其他3组潜伏期显著延长，说明造模对大鼠术后行为及认知功能具有一定影响；与对照组和氯化钠组比较，褪黑素组的潜伏期显著缩短、穿越平台次数显著增加、目标象限停留时间百分比显著增加、术后1、3、5d TNF-α、IL-10 水平明显降低，说明褪黑素可以明显降低炎性反应水平，通过抑制炎性反应，抑制氧自由基的释放，减轻神经元的损伤从而降低认知功能障碍的发生率。本实验结果表明，褪黑素预处理能够抑制炎症反应，减轻炎症因子对中枢神经系统的损害，降低术后POCD 的发生，更有利于提高患者的术后生存状态和生活质量。

综上所述，褪黑素预处理能够减少老年大鼠骨骼肌缺血再灌注后认知功能障碍的发生率，降低应激炎性反应，提高术后生存质量。