微小RNA在心房颤动中的研究进展*

汪尊冬 综述,刘维琴 审校

(贵州中医药大学，贵阳 550025)

微小RNA是由18～25个核苷酸组成的内源性非编码单链小RNA，它首次由LEE等在秀丽隐杆线虫中发现[1]。研究[2-3]表明，微小RNA在不同类型的组织和细胞中都有表达，其非调控表达对健康和疾病有重要影响。微小RNA通过与其靶基因mRNA的3′非翻译区碱基配对结合抑制mRNA翻译或沉默目的基因，从而达到抑制靶基因表达的目的。AKERMAN等[4]发现，1个微小RNA可以调控多个mRNA，而同1个mRNA可以是多个微小RNA的靶目标，所以微小RNA调控蛋白的途径是非常复杂的。微小RNA与肿瘤、神经系统、心血管系统疾病发病息息相关，通过介导细胞增殖、凋亡来抑制或促进疾病进展[5]。本文对微小RNA在心房颤动(简称房颤)发生和维持中的作用机制进行阐述。

1 微小RNA与电重构

电重构和结构重构是房颤的基础，而微小RNA通过介导离子通道重构、纤维化在电重构和结构重构过程中发挥重要作用。

房颤发生后数小时内离子通道发生重构，其特征是L型钙电流和瞬时外向电流显著下调，内向整流钾电流和乙酰胆碱依赖性钾电流上调。这些改变缩短了动作电位时程(APD)和有效不应期(ERP)，随着波长的缩短则有利于房颤的诱发和维持[6]。

1.1 Ca2+通道

房颤初期，心肌细胞反复除极导致细胞内Ca2+超载，从而引起离子通道的改变，故心房肌内钙超载被认为是房颤患者心房电重构的始动因素。在人心脏上表达的Ca2+通道蛋白的种类主要为L型钙通道蛋白(LTCC)和T型钙通道蛋白，而在维持“钙稳态”中发挥主要作用的是LTCC。房颤时细胞内钙超载，机体在自身保护机制作用下，L型电压依赖性钙通道亚基α1C和L型电压依赖性钙通道亚单位β1和β2(Cavβ1/2)的表达降低以减少细胞对Ca2+的摄入，而这一改变可能导致动作电位持续时间的缩短，有利于房颤的诱发和维持[6]。而在Ca2+通道改变的过程中，有许多微小RNA参与其中。

1.1.1miR-328

LU等[7]的研究结果显示，房颤犬模型的miR-328水平升高了3.9倍，房颤患者的miR-328水平升高了3.5倍。计算机预测，LTCC上的α1C和β1亚基的基因CACNA1C和CACNB1分别是miR-328的潜在靶点。他们又通过腺病毒转染和转基因方法使得miR-328在犬模型上过表达，这一结果提示房颤易感性增强，而L型钙电流减弱，心房动作电位时间缩短。当使用miR-328抑制剂时上述结果得到了反转。MCMANUS等[8]的研究也得到了类似的结果，房颤患者循环miR-328表达上调，调节LTCC密度，缩短心房有效不应期，增强房颤易感性。又有研究指出，房颤期间心房中CACNA1C和CACNA2B的表达降低，而miR-328升高，且伴随年龄的增加，miR-328表达升高[9]。LI等[10]分别将miR-328模拟物和miR-328抑制剂注射入新西兰大白兔右心房并快速起搏右心房，房颤模型建立7 d后检测发现，与阴性对照组相比，miR-328模拟物组心房有效不应期显著降低，而miR-328抑制剂组的心房有效不应期显著增加；在原代心肌细胞中通过调整miR-328的表达水平，发现CACNA1C蛋白表达趋势与miR-328表达趋势相反。

1.1.2miR-208a/b

1.1.3miR-21

miR-21在房颤患者中表达明显升高，与Ca2+亚单位α1C、β2(CACNA1C、CACNB2)表达呈负相关。miR-21转染HL-1细胞后，L型钙通道电流性质改变与房颤患者心房肌细胞L型钙通道电流相似，均明显降低[12]。

1.1.4miR-499

LING等[13-14]前期研究发现，在房颤患者右心耳组织中发现miR-499表达显著上升； 该研究之后的研究发现，与无房颤病史的窦性心律患者相比，永久性房颤患者心房肌CACNB2蛋白表达显著下调67%，且CACNB2蛋白的表达水平明显低于无房颤病史的窦性心律患者。结合微小RNA预测工具，猜测CACNB2是miR-499的靶基因，通过调控蛋白参与L型钙电流电重构。LING将miR-499模拟物与miR-499抑制剂分别转染入HL-1细胞中，结果发现转染miR-499的细胞中，CACNB2蛋白表达显著下调75%，而转染抑制剂的细胞中CACNB2蛋白表达上调2倍以上。然而在转染过程中检测发现，CACNB2 mRNA表达无明显变化，提示miR-499下调心肌细胞CACNB2的表达可能是由于抑制了蛋白质合成，下调LTCC亚单位参与电重构。

1.2 钾通道

人体心房、心室细胞上的钾离子通道可分为电压依赖性和受体启动性两大类型。其中，电压依赖性钾离子通道包括内向整流钾离子通道、瞬时外向整流钾离子通道和延迟整流钾离子通道3种。Kir2.1蛋白和内向整流钾电流上调是房颤相关离子重塑的一个标志；乙酰胆碱依赖性钾电流介导迷走神经对心率和心房复极的影响，其激活可缩短动作电位(AP)时程，引起超极化，对于房颤的诱发和维持有很大影响[15]。

1.2.1miR-1

miR-1是一种肌肉特异性表达的miRNA，在人心肌和骨骼肌中含量丰富[16]。GIRMATASION等[17]经过对62例左房组织样本(31例房颤)的检测，在房颤患者的组织样本中，miR-1的表达减少了约86%，而Kir2.1 mRNA(基因KCNJ2)显著增加。体外快速刺激人心房组织也得到上述类似结果。BILLCZKI等[9]的实验结果与上述研究一致，内向整流钾电流和Kir2.1蛋白表达随房颤的发生而升高，miR-1的表达却相反。JIA等[18]对家兔行起搏器起搏1周后检测得到的结果却与上述结果有所不同。起搏器起搏1周后，家兔心房组织中的miR-1表达增加，心房有效不应期缩短，延迟整流钾电流通道(Iks)显著增加。体内感染慢病毒后过表达miR-1使得心房有效不应期缩短，Iks增加；使用抗miR-1抑制剂寡核苷酸(AMO-1)后可逆转上述作用。荧光素酶活性测定证实KCNE1和KCNB2为miR-1的靶基因，KCNE1和KCNQ1编码缓慢激活的Iks。缓慢激活的Iks在动作电位平台的后期起作用，当Iks 增加时复极加快，动作电位时程(APD)缩短。miR-1表达增加可抑制KCNE1和KCNB2的表达，缩短右心房的有效不应期，增加房颤的易感性。

1.2.2miR-499

LING等[13]研究发现，永久性房颤患者右心耳中SK3蛋白的表达下降约46%，miR-499表达上升约2.33倍。使用预测工具提示与其他微小RNA相比，miR-499在靶向KCNN3方面的预测得分更高，荧光素酶报告显示KCNN3在其3′UTR中包含1个保守序列，与miR-499的种子位点互补。将miR-499模拟物与抑制剂分别转染HL-1细胞发现，转染miR-499的细胞中SK3蛋白表达下降，而转染miR-499抑制剂的细胞中SK3蛋白表达上升，这些结果都提示SK3受miR-499的调控。miR-499的种子序列在小鼠KCNN3和人KCNN3的3个转录本之间高度保守。因此，根据miR-499种子序列，人KCNN3的3个转录本可能都是miR-499的靶标。这一系列结果提示miR-499靶基因KCNN3调控的SK3可能参与房颤电重构的过程。

1.2.3miR-26a/b

miR-26a/b的表达在犬房颤模型及房颤患者中均明显减少(>50%)，与此同时发现Kir2.1蛋白和KCNJ2 mRNA的表达水平在房颤犬模型和患者中都增加。研究者将miR-26转染入H9C2中，与对照细胞相比，Kir2.1蛋白的表达明显下调；当使用AMO-26后可逆转这种抑制作用。用全细胞膜片钳检测细胞电位时发现，转染miR-26后的内向整流钾电流减少；使用AMO-26a后抑制了内向整流钾电流的减少[19]。研究者通过上述实验表明，miR-26的靶基因为KCNJ2，通过调整Kir2.1蛋白的表达，促进或抑制内向整流钾电流来影响房颤电重构。DU等[20]为研究长非编码RNA(lncRNA)TCONS-00106987在房颤发病中的作用发现，心房注射过表达TCONS-00106987病毒的新西兰大白兔的心房有效不应期(AERP)缩短，房颤诱发性增加；而TCONS-00106987抑制剂组的结果则相反。根据生物信息学研究结果，TCONS-00106987包含miR-26的结合位点。将TCONS-00106987与miR-26共转染原代心肌细胞后发现，miR-26可以部分逆转TCONS-00106987过表达引起的KCNJ2表达上调；而TCONS-00106987转染组中的KCNJ2表达明显增加。

1.2.4miR-30d

MORISHIMA等[21]检测了33例(房颤14例)右心耳组织样本，同时分离的新生大鼠心肌细胞。实验者使用miRNA微阵列平台，发现miR-30d和miR-499-5p在心肌细胞中高表达，进一步分析发现miR-30d是负责离子通道重构的候选miRNA。miR-30d可能的靶基因是KCNJ3，且与miR-30d呈负相关。在房颤患者心肌细胞中，miR-30d表达增加，而miR-30d靶基因KCNJ3表达减少。体外分离新生大鼠心肌细胞后过表达miR-30d，结果显示抑制心肌细胞KCNJ3mRNA和Kir3.1蛋白的表达，进而抑制乙酰胆碱依赖性钾电流的表达。相反，miR-30d基因敲除可上调KCNJ3 mRNA和Kir3.1蛋白水平。

1.3 钠通道

心脏钠通道传导的电流负责心肌细胞的快速去极化，对维持心脏的脉冲传导至关重要。心肌钠通道由成孔α亚基和辅助调节β亚基组成。α亚基由SCN5A基因编码；大多数影响心脏钠通道的突变都位于该基因上[22]。SCN5A基因编码心脏钠通道NaV1.5，当此基因突变或转录异常时，可以引发许多疾病例如：长QT综合征、Brugada综合征、房颤等[22-24]。

miR-192-5p：ZHAO等[24]在检测了风湿性瓣膜病房颤患者和对照组风湿性瓣膜病患者左心耳组织后发现，miR-192-5p与人SCN5A的3′-UTR结合，负向调节NaV1.5的表达，降低INa浓度。为了进一步确认miR-192-5p、SCN5A/ NaV1.5的关系，研究者分别将miR-192-5p模拟物和阴性对照miRNA模拟物转染人结直肠癌细胞、人结肠腺癌细胞和人胚胎肾细胞。实时荧光定量PCR分析显示，与阴性对照模拟物相比，miR-192-5p模拟物显著降低了SCN5A mRNA的表达水平，降幅为17%；Western blot分析表明，miR-192-5p模拟物与阴性对照模拟物相比显著降低了NaV1.5蛋白的表达水平66%。研究者用miR-192-5p反义寡核苷酸探针对房颤患者的左心耳进行原位杂交，房颤患者miR-192-5p的表达较非房颤患者显著上调1.6倍。miR-192-5p与SCN5A的3′-UTR结合，抑制NaV1.5的表达，降低INa浓度，在房颤诱发和维持中发挥作用。

2 微小RNA与结构重构

电重构是房颤发生初始阶段的病理改变，而结构重构是房颤得以长期维持的物质基础，也是心房最明显的改变[25]。心房扩张、心房纤维化是房颤结构重构的主要特征。心房纤维化可能导致传导速度减慢、传导阻滞以促进折返，增加房颤的易感性[26]。房颤组织电镜显示心房纤维方向混乱，线粒体数量增多和体积增加，细胞核增大，肌浆网和粗面内质网均有异常[27]。心房纤维化是多种心脏损伤纤维增殖信号通路共同作用的结果，血管紧张素Ⅱ、醛固酮和转生化长因子-β1(TGF-β1)对于纤维化有很大的促进作用[25]。

2.1 miR-21

心肌成纤维细胞的增殖在房颤患者的心肌纤维化和心房重构中起到了重要作用。与窦性心律组相比，房颤患者miR-21表达增加，而WW结构域包含蛋白1(WWP-1)表达降低；转染miR-21模拟物的心脏成纤维细胞可增加miR-21的表达，降低WWP-1的表达，而转染miR-21抑制剂后所起作用则相反[28]。另一研究[29]表明，快速心房起搏家兔可通过miR-21下调Smad7诱导心肌纤维化。转染miR-21抑制剂后，Smad7的表达明显增加，而Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达明显降低。成年大鼠心肌成纤维细胞用TGF-β1处理后发现miR-21表达增加，Smad7表达下降；使用TGF-β1抑制剂后可降低miR-21表达[29]。miR-21通过TGF-β1/Smad7信号通路介导房颤心房纤维化。ADAM等[30]、CARDIN等[31]、CAO等[32]的实验也得到类似结果。

2.2 miR-132

与对照组相比，miR-132在犬和人房颤标本中表达下调，结缔组织生长因子(CTGF)mRNA及蛋白的表达均上调[33]。为进一步确认miR-132与CTGF蛋白之间的关系，QIAO等[33]分别将miR-132、miR-132抑制剂及阴性对照转染入SD大鼠的心脏成纤维细胞，结果发现，与阴性对照相比，转染miR-132组CTGF mRNA表达下调；而转染miR-132抑制剂组中miR-132表达下调，CTGF mRNA表达上升。此外，该研究团队采用双荧光素酶报告系统检测到miR-132通过与CTGF的3-UTR结合而抑制CTGF的表达，可抑制心房纤维化进展。

2.3 miR-27b

WANG等[34]研究发现miR-27b是TGF-β1/ALK5/Smad-2/3信号通路的调节因子。研究者分别在动物及细胞层次进行实验，在血管紧张素Ⅱ诱导的房颤中miR-27b表达下调，过表达miR-27b通过调控靶基因ALK5/Smad-2/3信号通路表达抑制心房纤维化，这使得miR-27b成为一个治疗心房纤维化的潜在靶点。

2.4 miR-133a-3p

YAO等[35]的研究表明，miR-133a-3p是MIAT(心肌梗死相关转录本)的靶基因。与假手术大鼠组相比，房颤诱导后MIAT的相对表达显著增加；而miR-133a-3p的表达相对降低。使用慢病毒小发夹沉默MIAT组的房颤大鼠的AERP较房颤模型组的AERP明显延长；而当使用含MIAT沉默基因与抑制miR-133a-3p表达的病毒共感染组大鼠的AERP明显短于MIAT基因沉默组。与假手术组相比，右心房Mason胶原染色显示房颤大鼠右心房胶原含量明显增加，而MIAT基因敲除后房颤纤维化明显减轻；而予以抑制miR-133a-3p表达的病毒转染后显著逆转了通过敲除MIAT基因的缓解作用。MIAT/miR-133a-3p轴通过影响房颤大鼠纤维化相关基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、CTGF和TGF-β1的表达调节纤维化进展。

此外，miR-30c可抑制TGF-β1的表达，减少成纤维细胞的增殖、分化及胶原蛋白(Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白)的生成从而延缓心房纤维化的进程[36]。转化生长因子-β1受体3(TGFBR3)是miR-23b-3p和miR-27b-3p的靶基因，miR-23b-3p和miR-27b-3p通过靶向TGFBR3促进人心房成纤维细胞中Smad3的激活，从而促进心房纤维化，miR-23b-3p和miR-27b-3p可能是治疗房颤的潜在靶点[37]。使用miR-96抑制剂后可通过上调靶向Klf13 mRNA减弱Ang-Ⅱ诱导的小鼠心脏成纤维细胞的增殖、迁移和胶原生成，这又为治疗房颤提供了一个新可能[38]。

3 微小RNA与房颤治疗

目前尚未有文献报道将微小RNA运用于治疗临床上的房颤患者，而微小RNA更多的是进行房颤动物模型的治疗。LI等[10]分别将miR-328类似物与抑制剂注射入家兔心肌组织后快速右心房快速起搏，结果发现，与模型组相比，抑制剂组心房有效不应期显著延长。WANG等[34]将含miR-27b的病毒注射入小鼠心包腔内，然后使用血管紧张素构建心肌纤维化模型，14 d后检测发现，miR-27b病毒组心肌纤维化较空白病毒组明显减轻。

4 结 语

心房颤动是一种发病机制十分复杂的心律失常，具体发病机制目前尚未完全明确，但是微小RNA在房颤的诱发和维持中的作用越来越得到重视。微小RNA在外周血中稳定表达，操作简便，易于获得，对于房颤的诊断具有深远意义。目前虽尚无运用微小RNA治疗临床房颤患者的文献报道，但已有临床试验对微小RNA治疗作用进行评估：使用miR-34类似物治疗多发性实体瘤，miR-122抑制剂治疗丙型肝炎，miR-103/107抑制剂治疗糖尿病[39]等。随着研究的不断深入，对miRNA表达水平进行调控可以对房颤的进程进行干预，这为房颤新疗法提供了新的可能。