microRNA与雄性生育功能关系的研究进展

田 辉 赵晓曦

内蒙古医科大学第一临床医学院内蒙古医科大学附属医院（内蒙古 呼和浩特 010000）

microRNA（miRNA）是一类长度大约18-24个核苷酸的非编码RNA。miRNA 的产生是在细胞核中的RNA 聚合酶II（RNA polymerase II）的作用下，生成长度可达1000 个核苷酸并带有发夹结构的pri-miRNA，pri-miRNA 经过一种被称为“Drosha”的核糖核酸酶III(RNase III) 进一步加工，产生 miRNA 的前体(pre-RNA)，之后被exportin-5 转运到细胞质中，再由另一种核糖核酸酶III“Dicer”对pre-RNA 进行处理，产生一条双链miRNA，又经AGO2蛋白做最后处理，从而产生一条成熟的miRNA[1]。miRNA的主要调节方式是通过其5′端的2-8个核苷酸序列，与靶mRNA的3′-非编码区(3′-untranslated region，3′-UTR)结合，抑制靶 mRNA的翻译过程[2]。基于这种机制，miRNA 参与了哺乳动物约50%的基因表达与调控，而且一个miRNA往往可以作用于多个mRNA，一个基因也可以由多种miRNA来控制表达。miRNA在循环、呼吸、内分泌、以及生殖等系统中都有着非常丰富的表达，参与机体正常的生理活动。在疾病的发生和发展中，部分miRNA则会出现表达异常的情况，这些异常将带来一些病理变化，这标志miRNA检测具有潜在临床意义。

一、miRNA 参与精子发生

（一）miRNA在精子发生中的表达

精子发生可以被划分为三个阶段：二倍体精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）通过增殖分化形成精母细胞，精母细胞减数分裂形成单倍体精细胞，精细胞经变形形成成熟精子，精子发育成熟后会被储存在附睾中。在 2 月龄与 6 月龄、6 月龄与 12 月龄和 2 月龄与12月龄的小尾寒羊睾丸组织中可以分别检测出5个、1个和4个差异表达的已知的miRNA，以及132、105和24 个差异表达的未知miRNA[3]。小鼠SSCs 增殖分化时，miRNAs占总小RNA（total small RNAs）的19%，在减数分裂期间，最高会达到60%以上，减数分裂末期miRNAs 的量则会下降到小于5%，在成熟的精子中，miRNAs 的量约为40%。在小鼠的X-连锁miRNAs（X-linked miRNAs）家族中有19个基因位于SLITRK 2，3 个基因位于FMR1，而在人类中14 个miRNA 基因位于SLITRK 2，17 个基因位于FMR1[4]。这些数据表明，在不同物种之间的miRNA 前体序列具有高度的同源性。而且miRNA 在睾丸组织发育的不同时期表达会有差异，在精子生成的过程中，miRNA 的表达也会有较大的差异。

（二）miRNA参与SSCs的调控

SSCs 的增殖分化是精子发生的第一步，miRNAs可以通过各种通路调控SSCs 的增殖和分化。细胞周期蛋白（Cyclin）包括Cyclin A2、Cyclin B1 和Cyclin E1等，它们在调节细胞增殖的过程中至关重要。其中Cyclin B1 对于SSCs 的调控可能是通过Lin28a 和let-7 miRNA 实现的，敲除Cyclin A2、Cyclin B1 和Cyclin E1基因会导致人SSCs增殖下降，而提高miR-663a可以通过靶向抑制转录因子NFIX，调控Cyclin A2、Cyclin B1 和Cyclin E1 的表达，来促进SSCs 分裂[5]。小鼠睾丸中miR-30a-5p的下调可能导致胶质细胞系源性神经营养因子受体α1（GFRα1）的降低。GFRα1的降低则可以通过阻断GDNF/GFRα1/RET 信号通路，来促进SSCs 的自我更新[6]。支持细胞可以分泌的含有miR-486-5p 的外泌体，而SSCs中的miR-486-5p可以下调张力蛋白同源物基因（PTEN）和上调视黄酸刺激基因8（STRA8），这表明外泌体miR-486-5p可以通过PTEN/STRA8轴促进SSCs 的分化，抑制SSCs 我更新[7]。除上述miRNA之外，miR-322、和Hsa-miR-1908-3p 分别通过Ras相关结构域家族基因8（RASSF8）和Kruppel 样转录因子2（KLF2）来调控SSCs的增殖和凋亡[8,9]。这些数据表明，SSCs自身产生的miRNAs和外泌体miRNAs均可以参与SSCs的生理活动并且发挥着重要作用。

（三）miRNA参与精母细胞减数分裂

减数分裂前和减数分裂过程中所表达的miRNA有所不同。如 miR-10，miR-10-iso，miR-181，miR-148和miR-143 等在生殖细胞中的表达会随着减数分裂过程的进行逐渐减少。而miR-125、miR-15、miR-99、let-7、miR-143、miR-26、miR-127、miR-22 和 miR-30 等在减数分裂前表达增加，在精子细胞中的表达量会减少。在临近精母细胞减数分裂时，miR-34、miR-191、miR-470 和 miR-871 家族的表达均会增加[10]。Wang 等学者通过对鸡精子发生过程中STRA8（在调控减数分裂的起始中起着重要作用）的3′-UTR的miRNAs预测，构建了4 个miRNA，其中miR-31 可以直接靶向抑制STRA8 的表达从而抑制减数分裂的发生，随后将Gga-miR-218的干扰载体转染到鸡的SSCs中后发现与减数分裂相关基因STRA8、DAZL、SYCP3、NANOS3和DMC1有不同程度的下调，后经验证STRA8是GgamiR-218 靶点之一[11]。miR-29 家族是减数分裂中是一个重要的调节因子[10]：精母细胞中的miR-29 可以通过下调DNA 甲基转移酶3A（DNMT3A）的表达，使小鼠精母细胞减数分裂前期I 期mRNA 的靶基因被广泛抑制。目前研究显示多种miRNAs参与到了精母细胞的减数分裂过程中，虽有部分调控机制被证实，但是其中大部分调控机制尚不明确，仍需实验验证。

（四）miRNA参与精细胞变形和附睾功能

精母细胞在第二次减数分裂末期形成单倍体精细胞，呈圆形，需要经过变形才能形成“蝌蚪”状的成熟精子。在精子染色质浓缩变形的过程中，精细胞中的组蛋白被过渡蛋白（transition nuclear protein，TP）取代，在精细胞变长的时期，鱼精蛋白（Promatine，PRM）会取代TP，在此过程中，PRM可以使染色质变得稳定，不易发生突变。在圆形精细胞中表达的miR-122a 可以通过调控TP2，参与到过渡蛋白取代组蛋白的过程中。而 miR-469 可以通过结合 TP2 和 PRM2 的 mRNA 编码区，抑制TP2和PRM2蛋白表达，参与到精子变形的过程中。miR-888 也可以通过靶向控制精子相关抗原1和6（SPAG1、SPAG6）的表达，协助精子尾部的形成和结构的完整[12]。附睾是连接睾丸和输精管的组织，成熟的精子会在附睾中储存，并在此处进一步成熟，获得运动能力。在羊的附睾头和体之间有13个已知的miRNA 差异表达，头和尾之间有29 个，体和尾之间有22个，其中let-7、miR-541-5p、miR-133b和miR-150可能在羊附睾精子成熟调控中发挥重要作用[13]。睾丸和附睾头中由小管连接，这些小管中有类似输卵管中的纤毛组织，在把精子从睾丸送到附睾的过程中起着重要的作用。灭活小鼠的miR-34b/c 和miR-449 后，小鼠出现了精子成熟障碍的表现，而且睾丸重量增加，连接睾丸和附睾头的小管明显增大[14]。而与人类初级纤毛运动障碍相关基因DNAH6 是miR-34b/c 和miR-449 的靶点。因此推测，miR-34b/c 和miR-449 可能通过参与纤毛的发生影响精子的成熟。

二、miRNA与雄性精子质量、胚胎发育

（一）miRNA在男性不育中的表达

在全球范围内，约8-12%的夫妻患有不孕症，并且有相当部分不孕症患者的病因不明。而患有不孕症的夫妇中，男性因素达到了50%。其中无精子症（azoospermia）、少精子症（oligospermia，OS）、弱精子症（asthenozoospermia，AZS）和畸形精子症是男性不育的重要精液表相。Salas[15]在对8例精子参数正常、但是女方无法受孕的男性精液进行分析，并与对照组比较后发现，共有57个miRNAs在群体中差异表达（45个表达上调，12个表达下调），针对这些miRNAs，共预测了8606 个靶基因。另一项研究发现，在不育男性中有5种miRNAs显著上调，3种miRNAs表达下调，而且精子浓度与多种miRNAs 的表达水平（let-7a、miR-7-1-3p、miR-141、miR-200 A、miR-429）呈显著负相关[16]。鉴于miRNA在精子发生过程中的重要作用，miRNA也许可以成为男性不育的诊断依据和生物学标志，在男性不育诊治过程中起到作用。

（二）miRNA与无精子症、少精子症和弱精子症

无精子症患者可以分为梗阻性无精子症（OA）和非梗阻性无精子症（NOA）。有研究报道，在OA 与NOA患者的病例分析中发现hsa-miR-27a-3p的表达有显著差异，在NOA 患者精液中其表达为上调，并可以通过靶向下调赖氨酸去甲基化酶3A（KDM3A）参与NOA 的发生[17]。Cito[18]检测了 14 例 NOA 患者血浆中循环miR-20a-5p的表达，发现与正常人相比，其表达量显著增高。而在NOA 患者睾丸组织中miR-10b-3p 和miR-34b-5p的组合对NOA的诊断具有较高的准确度，可以作为诊断男性不育的生物学标志物。外泌体miRNAs的分析可能成为检测疾病或者判断身体情况的一种新手段，检测无精子患者精浆外泌体中miR-539-5p和miR-941的水平可以用于鉴定睾丸中是否有精子的存在[19]。运用这种方法可以在睾丸穿刺诊断NOA 前，给予医生参考。miR-371 家族在生殖系统肿瘤中得到了大量的研究，多数学者认为miR-371 家族具有成为睾丸生殖细胞肿瘤的新血清标志物的潜力。也有学者发现miR-371-3p的表达与精子浓度和精子总数显著相关，可以作为OS 的生物学标志物[20]。线粒体miR-17～92 的缺失可以破坏精子的发生：在仅敲除小鼠睾丸miR-106b～25 基因后，小鼠睾丸体积变小，表现为OS，但依然具有生育能力，而 miR-17～92 和 miR-106 b～25双基因敲除的小鼠则表现为睾丸组织严重受损，生育能力明显降低[21]。研究发现miRNA 在AZS 患者精液中的表达与正常人有差别，Heidary[22]在AZS 患者的精液里发现了18 种差异表达的miRNAs，其中miR-888-3p 的上调似乎与特发性AZS 有关。SEMG1是精子中一种重要的分泌蛋白，它参与了精子凝胶基质的形成。而AZS 患者SEMG1 基因的mRNA 和蛋白水平明显高于正常人，并且miR-525-3p 可以与SEMG1 基因的 3′-UTR 结合，靶向调控 SEMG1 蛋白的表达[23]。不仅如此，AZS患者精液中的miR-135a-5p可以通过靶向抑制Janus激酶2（JAK2），从而影响精子活力[24]。线粒体相关miR-4485-3p 被发现在AZS 患者精液中表达下调，并且其三个靶基因（DNAH 1、KIT 和PARK 7）可能通过影响线粒体功能，涉及AZS 的病理机制[25]。

（三）miRNA与畸形精子症和不良妊娠结局

精子贡献了胚胎50%的遗传物质，因此精子异常不但会影响受孕，而且还会影响到妊娠结局。精子的形态、膜的完整性、精子畸形率和精子DNA 完整性等因素异常是造成不良妊娠结局的重要因素。Gholami[26]用Westernblotting 方法检测畸形精子症患者miR- 582-5p和CRISP2（富含半胱氨酸的分泌蛋白，CRISPs）的表达量，发现miR-582-5p 在畸形精子症患者的精液里表达上调，而CRISP2 的表达下降，之后又检测畸形精子症患者精液CRISP3 的表达，并且测定了靶向CRISP3的 4 个 miRNAs，发现有三 个 miRNA（miR-182-5p，miR-192-5p 和 miR-493-5p）有上调，并且 CRISP3 糖基化亚型的表达水平明显低于正常人。推测miRNAs靶向调控CRISP2和CRISP3可能是畸形精子症发病的一个机制。精子染色质和DNA 异常被认为是早期流产的原因之一。精子DNA碎片指数（DFI）是一个体现精子DNA完整度和受损程度的指标。在高DFI的精浆标本中 miR-374b 和 miR-26b 的表达会下降[27]，因此miR-374b 和miR-26b 可能是反映精子质量的指标，从而预测产妇的妊娠结局。

目前对于OA、NOA、OS 和AZS 的诊断依赖于精液分析，但是精液分析对于男性不育的指导价值有限，并不能完全反应男性真实的生育能力。大量研究表明miRNAs在精子质量异常的精液里的表达有显著差异，可以作为生物学标记物参与到疾病的诊断中，但多数研究的重点是miRNAs的表达差异与OA、NOA、OS和AZS的相关性，对于具体调控机制的研究仍然不足。

（四）精源性miRNA与受精

通常认为人卵巢排出的卵子并未彻底完成减数分裂，还属于初级卵母细胞，其在输卵管内受成熟促进因子和细胞生长抑制因子的刺激发育到第二次减数分裂中期，而卵母细胞完成减数分裂就需要精子或者其他物质的作用才能进行，精子中所带的这种物质被称为精源性卵母细胞激活因子（sperm-borne oocyte activation factor,SOAF）。钙离子振荡是卵母细胞激活的一个重要机制，而磷脂酶 C-zeta（phospholipase C zeta,PLCz）作为卵母细胞钙离子震荡的重要调控因子现已被证实是SOAF 的一种，Schrimp R[28]在对汉诺威温血马的PLCz1 的基因经行测序后，发现在其基因内含子里含有miRNA 的基因序列，这说明miRNA 可能会参与到PLCz1的的表达，从而影响卵母细胞的激活。Li[29]在对比公猪新鲜的精子和获能的精子后发现了12个差异表达的 miRNAs（8 个已知 miRNAs，4 个未知 miRNAs）可能通过PI3K-AKT、MAPK、cAMP-PKA 和钙离子信号通路参与到精子的获能过程中。由此可见精源性miRNAs可以通过调控其靶基因参与到激活卵母细胞和精子获能的过程中，从而影响受精过程。

（五）miRNA与胚胎早期发育

在受精卵形成之后随即开始分裂，从单个细胞变更成多细胞囊胚的过程中有着多种因素的调控，miRNAs在其中也发挥着重要作用。有研究发现，miR-449b[30]在精子中的表达明显高于在卵子中的表达，在牛的1细胞胚胎、2 细胞胚胎和8 细胞胚胎时期，体外受精、体细胞核移植胚胎和孤雌激活胚胎之间的miR-449b表达并没有显著差别，并且精子携带的miR-449b 并没有下降。后续研究发现miR-449b 的过表达增加了体细胞核移植早期胚胎的整体组蛋白乙酰化水平、延长了胚胎的第一次卵裂时间、降低了胚胎凋亡指数，并测得 CDK6、C-MYC、HDAC 1 和 BCL-2 均是miR-449b 调控对象，这些数据说明精源性miR-449b可以通过调控上述基因的表达参与早期胚胎的发育。Alves[31]在对有着不同受孕率的冷冻公牛精子中的miRNAs 分析后发现有9 个miRNA 的表达有差异（miR-205、-505、-532、-33b、-126-5p、-216b、-339a、-500和-542-5p），而且与 miR-216b 呈负相关的K-RAS 在两细胞胚胎第一次卵裂和囊胚时期大量表达，由此推测精源性miR-216b 可能通过调控K-RAS 参与到牛胚胎早期的分裂。Qin[32]观察了普通受精组、体细胞核移植组（NT-C 组）和注射了精子携带的miRNA 的体细胞核移植组（NT-T 组）兔子的胚胎发育情况，发现NT-C 组的组蛋白H3 水平显著高于受精组和NT-T 组，NT-C 组的囊胚凋亡指数明显高于受精组和NT-T 组，NT-C 组胚胎的总细胞数显著低于受精组胚胎，注射精子携带的miRNA 可显著增加体细胞核移植囊胚的总细胞数。用精子介导的pLenti-III-GFP-miR-Off-Let-7a载体处理获得的卵母细胞经激活发育后，可以检测到卵母细胞中 miR-Let-7a 的表达降低、Toll 样受体 4（Toll-like receptor 4，TLR4）在基因和蛋白质水平上表达较高、并且观察到滋养层细胞向子宫内膜细胞的附着和迁移显著增加，这说明miR-Let-7a 通过调控TLR4，参与到胚胎的着床过程[33]。先前的实验发现精源性miR-34c 是小鼠受精卵第一次分裂不可或缺的调控因素，而后另一篇报道发现miR-34b/c 和miR-449 是精子发生所必须的，但不是在受精或者胚胎发育之前不可缺少。造成矛盾结果的原因可能是先前的研究使用的是miR-34c的抑制剂，而且 miR-34c 属于 miR-34a、miR-34b/c 和miR-449a/b/c 家族，它们拥有相同的 3′-UTR 识别种子序列，因此它们都是功能冗余的，家族中的一个失活不会影响表型[34]。miRNAs 在胚胎发育过程中的研究主要以母体产生的miRNAs 和胚胎发育过程中出现的miRNAs为主，对于精子携带的miRNAs在这一邻域的研究还处于起步阶段，而且部分功能和调控机制还存在争议，仍然需要学者继续努力。

总结与展望

男性不育病因目前尚未完全明确，因此男性不育的治疗也难以展开。已有的研究表明，精液质量是引起男性不育的重要因素，精子在发生过程中出现异常将会极大的影响精液质量。目前已有大量学者们发现了众多与调控精子发生和男性生育相关的miRNAs差异表达和调控通路，包括调控SSCs的增殖分化、减数分裂、精细胞变形和附睾功能，其中差异表达的miRNAs可以做为生物学标志为医生提供参考。发现更多miRNAs在其中的作用有助于明确男性不育的病因，为诊断和治疗提供新思路。由于精子携带的miRNAs 在受精及胚胎的早期发育过程也起着重要作用，异常的精源性miRNAs也会导致胚胎发育异常，甚至造成流产等不良妊娠结局。胚胎发育异常被认为是流产的主要因素之一，但依然有一半的流产病因无法确定，深入研究精源性miRNAs在胚胎发育过程中的作用机制有助于了解流产的病因，从而探讨新的预防、诊断和治疗的方法。