萘酚对煤气化废水微生物菌群结构的影响

范凯琪，孔令翯，邓文慧，盖恒军，肖 盟

(青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042)

煤热解过程中产生的大量有机污染物，如酚类化合物、杂环类化合物和多环芳烃等，具有较高的生物毒性，使得煤气化废水的可生化性较差，生化处理难度大[1]。因此，在进行生化处理前，先对煤气化废水进行“酚氨回收”等预处理工艺以去除大部分有机污染物，但生化系统仍存在运行不稳定的现象。酚类化合物是生化进水中的主要污染物及关键致毒物质，包括苯酚、甲酚、乙基苯酚及萘酚等。其中萘酚在煤气化废水中广泛存在，在自然界中可被微生物降解为1,2-二羟基萘、龙胆酸等小分子化合物。生物毒性分析表明，萘酚的半数有效浓度(EC50)值为2.59 mg·L-1，而苯酚的EC50值为359.97 mg·L-1[2]。因此，虽然萘酚在煤气化废水中含量相对较低，但其仍具有较高的生物毒性。

在废水处理过程中，微生物菌群能够根据进水中污染物的不同发生相应的变化，以维持稳定的菌群结构及性能。Yang等[3]研究了吲哚对含酚模拟废水微生物菌群结构的影响，发现苯酚可作为代谢基质促进吲哚的降解，其中Thermomonas、Pseudomonas、Comamonas、Dyella在苯酚和吲哚的代谢过程中发挥了重要作用。Huang等[4]研究了焦化废水中微生物与污染物的相关性，发现Enterobacter、Pseudomonas和Sedimentibacter与苯酚的降解有关，而Pseudomonas、Sedimentibacter、Comamonas、Dysgonomonas则与萘酚的降解呈正相关性。目前，关于萘酚对煤气化废水微生物菌群结构的影响尚未见报道。鉴于此，作者采用高通量测序技术研究萘酚对煤气化废水污泥中微生物菌群结构的影响，并探讨功能微生物的相对丰度变化及相关性，以进一步阐释煤气化废水中微生物对萘酚的响应机制，为煤气化废水中萘酚的生物降解提供理论支撑。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

污泥，取自内蒙古某煤化工企业污水生化处理厌氧段。

萘酚(质量分数98%)、苯酚(质量分数98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸乙酯、无水硫酸钠、NaCl，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

5B-3F型COD测定仪，北京连华永兴科技发展有限公司；岛津2014C型气相色谱仪，岛津企业管理(中国)有限公司；HZQ-C型空气浴恒温振荡器，哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.2 培养基

无机盐培养基(MSM，g·L-1)：K2HPO41.0，KH2PO41.0，CaCl20.01，NaNO30.5，FeSO4·7H2O 0.1，MgSO40.5，NH4Cl 1.0；pH值7.0，121 ℃高压灭菌20 min。

苯酚-无机盐培养基：配制一定浓度的苯酚储备液，取适量加入到250 mL锥形瓶中，加入适量无机盐培养基，使苯酚终浓度为250 mg·L-1，121 ℃高压灭菌20 min。

1.3 污泥驯化

将苯酚-无机盐培养基加入到500 mL螺口瓶中，污泥接种量MLSS为3 500 mg·L-1，总反应体积为400 mL，用橡胶塞封口并通入适量空气，置于35 ℃恒温振荡器中，对污泥进行驯化，溶解氧(DO)在0.1～0.5 mg·L-1之间，水力停留时间为48 h。运行30 d后，将适量萘酚加入进水中，使其浓度控制在3 mg·L-1，作为萘酚组(简称N)；并以不添加萘酚作为对照组(简称C)。每隔48 h参照HJ 828-2017《水质 化学需氧量的测定 重铬酸盐法》测定进、出水COD，并计算COD去除率。用乙酸乙酯萃取出水中的污染物，采用气相色谱法测定出水中苯酚和萘酚的残留量。

气相色谱条件：以N2为载气，检测器温度250 ℃，进样器温度270 ℃；初始柱温100 ℃保持1 min，以20 ℃·min-1的速度升温至230 ℃，终温230 ℃保持1.5 min[5]。

1.4 菌群DNA的提取及测序

出水水质运行稳定后，取适量污泥，用DNA提取试剂盒提取污泥总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用NanoDrop 2000检测DNA的含量和纯度。采用16S rDNA 通用引物扩增细菌DNA的V3-V4区，正向引物341F为 5′-CCTACACGACGCTCTTCCG-ATCTNCCTACGGGNGGCWGCAG-3′，反向引物805R为5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-ATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′[6]。对PCR扩增产物进行电泳回收、定量分析后，采用Illumina MiSeq平台进行测序，每组样品做4个平行，结果取平均值。测序由深圳华大基因科技服务有限公司完成。

1.5 高通量测序及分析

采用华大基因扩增子分析平台对测序结果进行分析。测序所得原始序列经拼接和质控后，对所得操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)进行聚类分析和物种分类学分析，采用Wilcoxon Rank-Sum Test进行alpha多样性分析，使用QIIME软件进行主坐标分析(principal coordinate analysis，PCoA)。在门、属等水平绘制物种相对丰度柱状图，属水平中物种相对丰度<0.5%和没有注释到的物种均合并为Others；在门水平进行物种差异性分析，使用FDR(false discovery rate)评估差异的显著性。选取相对丰度前10的物种进行差异显著性检验。使用R(V3.4.1)和Cytoscape绘制物种相关性网络图。

2 结果与讨论

2.1 萘酚对出水水质的影响

进、出水COD及COD去除率如图1所示。

图1 进、出水COD(a)及COD去除率(b)Fig.1 COD of influent and effluent(a) and COD removal rate(b)

由图1可知，对照组进水COD约520 mg·L-1，出水COD约30 mg·L-1，COD去除率在90%以上，表明微生物对苯酚的降解效果较好。萘酚组进水COD约560 mg·L-1，在初始运行阶段，出水COD平均值约75 mg·L-1，但随着运行时间的延长，运行30 d后出水COD维持在50 mg·L-1左右，COD去除率达90%左右。出水中未检出苯酚和萘酚，表明经生化处理后，苯酚和萘酚降解较为彻底。

2.2 萘酚对菌群多样性的影响

菌群的alpha多样性如图2所示。

图2 alpha多样性分析Fig.2 Alpha diversity analysis

由图2可知，对照组和萘酚组的Chao1指数没有显著性差异(图2a)，表明两组菌群丰度较为接近。萘酚组的Shannon指数显著低于对照组(P=0.0287<0.05)(图2b)，表明加入萘酚后菌群多样性下降。PCoA分析(图3)显示，萘酚能够显著影响菌群的物种分布(PERMANOVA，P<0.05)。

图3 主坐标分析Fig.3 PCoA analysis

2.3 菌群结构分析

门水平物种的相对丰度如图4所示。

图4 门水平物种相对丰度柱状图Fig.4 Relative abundance histogram of major microbial species at phylum level

由图4可知，对照组中，β-变形菌纲(Betaproteobacteria)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)为优势菌门，相对丰度分别为48.0%和19.4%，其次为α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、Ignavibacteria和鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)，相对丰度分别为5.1%、4.7%和4.2%。萘酚组中，Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Alphaproteobacteria为优势菌门，相对丰度分别为31.3%、22.9%和20.1%，其次为Sphingobacteriia、Ignavibacteria和δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)，相对丰度分别为5.0%、4.5%和3.1%。加入萘酚后，Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria仍是优势菌群，Betaproteobacteria的相对丰度降低了16.7%；Alphaproteobacteria、Sphingobacteriia、Deltaproteobacteria的相对丰度均显著高于对照组，表明萘酚对Betaproteobacteria有一定的抑制作用，但对Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Sphingobacteriia和Deltaproteobacteria无抑制作用。

2.4 关键物种差异分析

属水平物种的相对丰度如图5所示。

图5 属水平物种相对丰度柱状图Fig.5 Relative abundance histogram of major microbial species at genus level

由图5可知，对照组中，Thermomonas的相对丰度最高(11.3%)，其次为Alicycliphilus、Ignavibacterium、Zoogloea、Caldilinea和Georgfuchsia，相对丰度分别为6.7%、4.6%、2.7%、2.6%和2.1%，其中相对丰度<0.5%的物种约占总菌群的62.6%。萘酚组中，Azospirillum的相对丰度最高(17.7%)，其次为Thermomonas(12.4%)，此外，Alicycliphilus(7.4%)、Ignavibacterium(4.3%)、Georgfuchsia(2.4%)、Caldilinea(2.1%)的相对丰度也较高。

选取相对丰度前10的物种作为关键物种进行差异性分析，结果如图6所示。

图6 关键物种相对丰度差异柱状图Fig.6 Relative abundance difference histogram of key species

由图6可知，萘酚组中，Thermomonas、Alicycliphilus的相对丰度略有升高，但并不显著(P>0.05)，表明这两类微生物受萘酚的影响较小。对照组和萘酚组中，Thermomonas、Alicycliphilus、Ignavibacterium和Caldilinea的相对丰度均较高。其中，Thermomonas是一类具有反硝化性能的芳香族化合物降解菌[3]；Alicycliphilus是一类能够利用氧、硝酸盐、氯酸盐作为最终电子受体，在好氧和缺氧条件下降解外源污染物的细菌，所涉及的外源污染物包括苯、甲苯、萘、蒽等单环和多环芳烃类化合物及含氮杂环类化合物[7]；Ignavibacterium是一类异养发酵细菌，能够在厌氧条件下降解酚类化合物[8]；Caldilinea属绿弯菌门，在厌氧消化系统中通常占有较高丰度，是一类互养型细菌，对甲烷的产生具有较强的促进作用[9]。这4类微生物在菌群结构中相对丰度较稳定，表明其能够适应不同酚类污染物且能够耐受萘酚的毒性，是降解苯酚和萘酚的主要物种。与对照组比较，萘酚组中Azospirillum、Georgfuchsia、Flavihumibacter的相对丰度显著升高(P<0.05)，说明这3类微生物具有降解萘酚的性能或与其它物种协同作用实现萘酚的降解。其中，Azospirillum对酚类化合物具有较强的降解性能[10]，多见于根际微生物中，对苯甲酸盐类杀虫剂具有较高的耐受性[11]；Georgfuchsia属β-变形菌纲，是一类在严格厌氧条件下利用硝酸盐、Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅳ)作为电子受体降解单环芳烃的反硝化细菌[12]；Flavihumibacter在多环芳烃降解菌群的富集过程中常具有较高丰度[13-14]。与对照组比较，萘酚组中Zoogloea、Thauera和Parvibaculum的相对丰度显著降低(P<0.05)，表明在萘酚作用下，其生长代谢活性受到抑制。

物种相关性网络图(图7)可以直观展示物种间的相关性。其中，Thermomonashaemolytica、Flavihumibactersolisilvae、Gemmatimonasaurantiaca分别与Ignavibacteriumalbum、Caldilineatarbellica呈正相关性，表明这些微生物之间存在协同关系。Thermomonashaemolytica、Flavihumibactersolisilvae和Gemmatimonasaurantiaca均具有降解芳烃类化合物的性能，萘酚经降解后开环可生成小分子化合物，这些小分子化合物可通过Ignavibacteriumalbum和Caldilineatarbellica的进一步降解实现萘酚的去除。由此可见，加入萘酚后，部分降解多环芳烃及酚类化合物的功能微生物的相对丰度升高，在菌群协同作用下可实现萘酚的有效去除。

图7 关键物种相关性网络图Fig.7 Correlation network diagram of key species

3 结论

采用高通量测序技术研究了萘酚对煤气化废水污泥中微生物菌群结构的影响，探讨了功能微生物的相对丰度变化及相关性。结果表明，加入萘酚后，出水COD升高，运行30 d后，出水COD可稳定在50 mg·L-1左右；菌群的多样性降低，且菌群的物种分布显著改变，其中Betaproteobacteria的相对丰度降低，Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Sphingobacteriia、Deltaproteobacteria的相对丰度有所升高。关键物种差异性分析表明，加入萘酚后，Thermomonas、Alicycliphilus、Ignavibacterium和Caldilinea的相对丰度没有显著变化，但Azospirillum、Georgfuchsia、Flavihumibacter等具有酚类、多环芳烃降解性能的微生物的相对丰度显著升高(P<0.05)，且Thermomonashaemolytica、Flavihumibactersolisilvae、Gemmatimonasaurantiaca分别与Ignavibacteriumalbum、Caldilineatarbellica呈正相关性，推断通过这些功能微生物的协同作用可降低出水COD，实现萘酚的有效去除。