MicroRNA-31-3p靶向调控Sema4C表达对宫颈癌顺铂耐药性的作用及其机制研究*

张华章，黎婧，刘智慧

[华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院（武汉市妇幼保健院）妇一科，湖北 武汉 430019]

宫颈癌是排第4 位的女性常见癌症，也是女性第二癌症致死原因，女性中发病率仅次于乳腺癌[1]。临床上，手术、放射治疗和化学药物治疗（以下简称化疗）已被广泛用于提高宫颈癌患者的生存率。但由于原发性和继发性化疗耐药的产生，晚期宫颈癌患者的5 年生存率仍然很低。深入研究宫颈癌患者化疗耐药发生、发展的机制，有利于提高预后水平。大量研究表明，microRNA（miRNA）在肿瘤细胞进展过程中发挥关键作用，如癌细胞生长、凋亡和转移[2]。MicroRNA-31-3p（miR-31-3p）在多种癌症组织中异常表达，如结肠癌[3]、口腔癌[4]和脑胶质瘤[5]。miR-31-3p 在宫颈癌中低表达，并且通过Mirbase 数据库筛选发现Sema4C 是miR-31-3p 的靶基因。有研究证明，Sema4C 可调节宫颈癌上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）及对顺铂化疗的敏感性，但其相关机制尚不清楚[6-7]。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人宫颈癌细胞系Hela、人正常宫颈细胞系、RPMI 1640 培养液、PCR 引物购自南京擎科生物科技有限公司，PCR 试剂盒（济南诺维赞生物科技有限公司），miR-31-3p mimics（广州锐博科技有限公司），Sema4C 过表达质粒（上海吉凯基因科技有限公司），LipofectamineTM3000 转染试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）、CCK-8试剂（日本东仁化学科技有限公司），抗Sema4C、GAPDH、山羊抗兔IgG HRP二级抗体购自美国Abcam公司，BCA蛋白质分析试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 主要仪器

细胞培养培养箱、实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）仪（Step One Plus）、多功能酶标仪、低温高速离心机、高速低温离心机、-80℃冰箱购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，电泳仪、转膜仪购自北京六一仪器厂，化学发光检测仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 将人宫颈癌细胞Hela 和人正常宫颈细胞放入RPMI 1640 培养液，内含10% FBS，100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素，培养液放置于37℃、5%二氧化碳增湿培养箱中。

1.3.2 细胞转染 取对数生长期Hela细胞均匀接种在6孔板中。将Opti-MEM培养基预混LipofectamineTM3000 试剂，分别转染 m iR-31-3p mimics（miR-31-3p mimics 组）、空白质粒（对照组），以及在转染miR-31-3p mimics 的基础上过表达 Sema4C（miR-31-3p mimics＋Sema4C 组）10～15 min，继续置于恒温培养箱中静置培养2～3 d，用于后续实验。

1.3.3 qRT-PCR检测miR-31-3p的表达 分离并纯化Hela 细胞、人正常宫颈细胞总RNA，检测RNA纯度并逆转录成cDNA，按照PCR 试剂盒说明书进行qRT-PCR。反应体系：SYBER Green Mix 10 μL、正反向引物（10 μ mol/L）各 0 .5 μ L、cDNA 2 μL、H2O 2 μL。PCR 反应条件：95℃预变性 5 min，94℃变性45 s，62℃退火 4 5 s，72℃延伸 1 min，共 4 0 个循环，60℃继续延伸 2 5 min。以U6为内参基因，2-ΔΔct法计算相对表达量。qRT-PCR引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 Western blotting 检测Sema4C 蛋白的表达 收集Hela 细胞并在RIPA 缓冲液中溶解。使用BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到硝化纤维素膜上。BSA 封闭后，用抗Sema4C 和GAPDH 的一抗孵育，山羊抗兔IgG HRP 的二抗（1∶2 000）处理条带，并使用化学发光物质检测条带。

1.3.5 CCK-8 法检测细胞吸光度 取对数生长期miR-31-3p mimics 组、对照组、miR-31-3p mimics+Sema4C 组Hela 细胞，消化分离并加入完全培养基重悬，制成细胞悬液，种植于96 孔板中，每孔约3 000个细胞。按比例配制 1 μ mol/L、2 μ mol/L、3 μmol/L、4 μmol/L、5 μmol/L、6 μmol/L 顺铂。取出两组原有培养基，加入含相应浓度药物的培养基，细胞在37℃、5%二氧化碳CO2培养箱内培养24 h。除去培养基，配制CCK-8 工作液，每孔加入100 μL CCK-8 溶液，细胞在培养箱内培养1～5 h。用酶标仪测定450 nm 处的吸光度，计算细胞生存率。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 24.0 和Graphpad Prism 8.0统计软件。计量资料以均数±标准差（）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hela细胞中miR-31-3p的表达

qRT-PCR结果表明，Hela细胞与人正常宫颈细胞miR-31-3p 相对表达量分别为（0.43±0.32）和（1.06±0.12），经t检验，差异有统计学意义（t=3.193，P=0.033），Hela细胞miR-31-3p低于人正常宫颈细胞。

2.2 miR-31-3p靶向调控Sema4C的表达

利用生物信息学方法预测miR-31-3p 可靶向结合Sema4C基因（见图1）。qRT-PCR 结果表明，对照组、miR-31-3p mimics 组、miR-31-3p mimics+Sema4C组 miR-31-3p 相对表达量分别为（1.05±0.32）、（2.11±0.49）和（2.08±0.32），经方差分析，差异有统计学意义（F=12.280，P=0.001）。进一步两两比较结 果 ：miR-31-3p mimics 组 、miR-31-3p mimics+Sema4C 组 miR-31-3p 相对表达量高于对照组（P＜0.05）；miR-31-3p mimics 组 与 miR-31-3p mimics+Sema4C 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 miR-31-3p靶向结合Sema4C基因

对 照 组 、miR-31-3p mimics 组 、miR-31-3p mimics+Sema4C 组Sema4C 蛋白相对表达量分别为（1.02±0.25）、（0.41±0.24）和（0.66±0.13），经方差分析，差异有统计学意义（F=10.296，P=0.002）。进一步两两比较结果：miR-31-3p mimics 组、miR-31-3p mimics+Sema4C 组Sema4C 蛋白相对表达量低于对照组（P＜0.05）； miR-31-3p mimics+Sema4C 组 高 于miR-31-3p mimics组（P＜0.05）。见图2。

图2 Hela细胞中Sema4C蛋白的表达

2.3 不同浓度顺铂作用下各组Hela细胞生存率比较

CCK-8 法结果表明，不同浓度顺铂作用下，对照组、miR-31-3p mimics 组、miR-31-3p mimics+Sema4C组Hela 细胞生存率比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较：miR-31-3p mimics 组 H ela 细胞生存率低于对照组（P＜0.05）；2 μmol/L、3 μmol/L、4 μmol/L、5 μmol/L 顺铂作用下，miR-31-3p mimics+Sema4C 组 H ela 细胞生存率高于 m iR-31-3p mimics 组（P＜0.05），表明 m iR-31-3p调控Hela 细胞铂类耐药，过表达Sema4C 可抑制miR-31-3p 的作用。见表2。

表2 不同浓度顺铂作用下各组Hela细胞的生存率变化 （%，）

表2 不同浓度顺铂作用下各组Hela细胞的生存率变化 （%，）

组别对照组miR-31-3p mimics组miR-31-3p mimics+Sema4C组F 值P 值1 μmol/L顺铂100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 2 μmol/L顺铂95.32±7.63 76.81±7.24 88.23±3.54 10.622 0.002 3 μmol/L顺铂83.58±7.63 66.89±4.38 76.25±3.45 11.755 0.001 4 μmol/L顺铂75.32±7.63 49.86±10.53 65.45±3.45 13.656 0.000 5 μmol/L顺铂63.25±7.24 32.18±2.58 38.23±6.54 39.961 0.000 6 μmol/L顺铂47.86±6.78 27.34±6.21 27.68±5.23 18.510 0.000

3 讨论

有研究表明，宫颈癌的发生与人乳头状瘤病毒感染有关[8]。随着宫颈癌组织的病理检查和早期诊断的加强，已显著降低了该病的发病率和病死率[9]，但宫颈癌仍然是威胁女性健康的第2 大因素。对晚期患者，宫颈癌耐药的产生是限制患者预后的主要因素之一。目前已有大量关于宫颈癌的研究，但宫颈癌耐药发生、发展的具体机制仍不清楚。

目前越来越多的证据表明，miRNA 在多种肿瘤和其他疾病的诊断、治疗及预后中发挥重要作用[10-11]。例如，miR-146a-5p 在多种肿瘤中异常表达，并且miR-146a-5p 可能作为一种非侵入性生物标志物对多种肿瘤有靶向治疗有用[12]。miR-31-3p编码基因位于染色体9p21.3，参与多种肿瘤细胞的发生、发展。在脑胶质瘤中，miR-31-3p 扮演了重要角色，过表达miR-31-3p 可显著降低MAD2L1 表达，并且通过生物信息学技术分析得出miR-31-3p 的靶基因涉及细胞增殖、转录及肿瘤等信号通路[5]。有研究证实，通过下调STAT3 的表达，miR-31-3p 还可抑制横纹肌肉瘤细胞增殖和迁移[13]。在结肠癌中，miR-31-3p 表达水平可作为西妥昔单抗对RAS-WT mCRC 患者疗效的预测性生物标志物[14]。同样在结肠癌中，与miR-31-3p 高表达患者相比，在预处理活检中miR-31-3p 低表达的患者有更高的总有效率，以及更高无进展生存率和总生存率[3]。

本研究结果表明，miR-31-3p 在宫颈癌细胞中低表达，与多种癌症中的表达一致；上调miR-31-3p的表达可显著提高宫颈癌细胞对顺铂的化疗敏感性。本研究采用生物信息学技术预测了miR-31-3p可靶向调控Sema4C的表达，并进一步验证miR-31-3p通过靶向调控Sema4C 的表达，影响宫颈癌细胞对顺铂的耐药性。本研究不仅探究miR-31-3p 在宫颈癌顺铂化疗中产生耐药的机制，同时也证实Sema4C 表达的调控机制。

Sema4C 的高表达能显著降低宫颈癌细胞对顺铂的化疗敏感性[7]。更有研究证明，Sema4C 可促进宫颈癌细胞的侵袭和转移[6]。Sema4C 参与多种肿瘤的发生、发展，也是许多miRNA 的靶点，包括miR-125b、miR-25-3p、miR-205、miR-138 及miR-31。Sema4C 参与EMT 介导的许多恶性肿瘤的化疗耐药，包括乳腺癌、宫颈癌、肝癌和肺癌。miR-125b 在乳腺癌、肺癌中的异常表达和miR-25-3p 在CC17 中的异常表达可显著逆转EMT 表型，并通过下调Sema4C表达调节疾病进展，完全缓解诱导的EMT。有研究证明，Sema4C 可通过p38-MAPK 影响卵巢癌细胞增殖[15]；在乳腺癌中，Sema4C 在与肿瘤相关的淋巴管内皮细胞中高表达，可介导肿瘤淋巴转移，影响乳腺癌细胞增殖，还可以作为乳腺癌的重要标志物[16-17]；在结肠癌中，Sema4C 的过度表达导致大肠癌细胞的侵袭和迁移率升高[18]；在脑胶质瘤中，Sema4C 的表达受miR-138 靶向作用，并促进脑胶质瘤细胞侵袭和转移[19]。这些结果都表明靶向Sema4C 可作为逆转肿瘤化疗耐药的新途径。

综上所述，miR-31-3p 通过靶向调节Sema4C 的表达，调控宫颈癌细胞对顺铂的耐药性。本研究为宫颈癌的治疗提供了新的靶点和理论基础。