小反刍兽疫流行状况及分子诊断技术研究现状

吴昊天，满初日嘎，王凤阳，李 昌，金宁一，陈巧玲*

(1.海南大学动物科技学院/海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室，海南海口 570228；2.军事医学研究院军事兽医研究所,吉林长春 130122)

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)也称为羊瘟、小反刍兽假性牛瘟、肺肠炎，是一种以山羊、绵羊、鹿、骆驼以及其他野生小反刍动物为主要感染对象的病毒性疾病。近年来在牛、水牛、牦牛、猪、狗、吸血蠓等多种动物体内都分离到PPRV或检测到过病毒核酸，或可在实验条件下人为感染[1]。骆驼和牛已经被证实是PPRV的偶然宿主，感染PPRV的骆驼和牛不会继续传播PPRV[2]。PPR分为急性型、标准型和温和型，典型临床症状为发热、腹泻、呼吸困难、口腔与鼻黏膜溃疡和结膜炎等[3]，急性型患畜出现发热和结膜炎症状后便迅速死亡，标准型则会出现多种典型临床症状，少部分仅有口腔病变的温和型病羊能够恢复，多数会在发病后数天内死亡[4]。

PPR是世界动物卫生组织(OIE)规定的必须报告的动物疫病，在我国属于一类动物疫病。PPR给全球养羊业造成了巨大的损失。根据OIE、世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)的数据，截止2019年5月，全球仍有67个国家有PPR流行，这些国家的小反刍动物数占世界总数的68%，超3亿以饲养小反刍动物为生的家庭受PPR直接影响[5]。据不完全统计，全球每年因PPR带来的经济损失可达15亿～20亿美元。我国周边国家如印度、阿富汗、巴基斯坦、尼泊尔等，PPR疫情常年呈地方性流行，给我国的PPR防控带来了严峻的挑战。

1 小反刍兽疫的病原学

PPR的病原是小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)，为单股负链RNA病毒，属副黏病毒科、麻疹病毒属的成员。自然条件下主要感染各类小反刍动物，人工条件下可以在原代牛和绵羊细胞以及某些细胞系(如Vero细胞和B95a细胞)中生长。该病毒感染细胞3 d～5 d后，会导致宿主细胞出现特定的细胞病变,最初细胞呈葡萄簇状，然后空泡化，细胞质颗粒化，最后形成特异性合胞体。PPRV大小为150 nm～700 nm，由N蛋白、P蛋白和L蛋白相连共同组成的核衣壳复合体与单股负链无节段RNA基因组构成。PPRV基因组包含6个基因，分别编码核衣壳蛋白N、磷蛋白P、融合蛋白F、基质蛋白M、血凝素蛋白H/HN和大蛋白L等6种结构蛋白质以及C、V两种非结构蛋白质，依次为3′-N-P/C/V-M-F-H/HN-L-5′。其中M、F、H和N 4种蛋白质能够形成PPRV的病毒样颗粒(VLPs)，可诱导山羊产生足够抵抗PPRV感染的中和抗体[6]。

1.1 小反刍兽疫病毒各蛋白与功能

N蛋白是PPRV最主要的结构蛋白之一。N蛋白的作用是与M蛋白共同促进病毒的组装，并参与P-L聚合物复合物形成。PPRV的 N蛋白编码区起始于核苷酸位点108(UAC)，终止于1 685位点(AUU)，蛋白大小为59 ku，其最高免疫活性区在425-472氨基酸位点。根据不同毒株间基因相似度可以将N蛋白划分为4个区域，分别为区域1(氨基酸位点1-120位)、区域2(氨基酸位点122-145位)、区域3(146-398位)和区域4(421-525位)，其中区域3保守性最高，区域4保守性最低[7]。

P蛋白基因起始于1 807位碱基，编码大小约60 ku的P蛋白，这段基因序列的替代阅读框也可以产生C蛋白和V蛋白两种非结构蛋白。麻疹病毒属病毒的P蛋白都是磷酸化蛋白，存在5个保守的丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点。P蛋白有助于L蛋白的正确折叠。研究表明，P蛋白可以抑制信号转导与转录激活因子 1 (STAT1)的磷酸化，进而阻断JAK-STAT信号传导途径，从而抑制干扰素产生[8]。

M蛋白基因位于3 428-4 445位碱基之间，麻疹病毒属中高度保守，在属内相似度高达91%，作用为连接N蛋白与表面糖蛋白。M蛋白还是促进PPRV的病毒样颗粒组装和释放的组分[9]。

H蛋白基因位于7 326-9 155位碱基之间，麻疹病毒属的H蛋白位于囊膜，可将病毒吸附于宿主细胞的细胞膜上。PPRV的H蛋白还具有红细胞凝集素和神经氨酸酶的作用，因此也被称为血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)。H蛋白在PPRV感染山羊的过程中，可以降低山羊体内能够抑制PPRV复制的亲环蛋白A(CypA)的水平，从而拮抗山羊的抗病毒反应[10]。麻疹病毒属中H蛋白的保守性极低，是不同种类的麻疹病毒细胞嗜性以及产生的体液免疫不同的主要原因。

F蛋白基因位于5 526-7 166位碱基之间，F蛋白与H/HN蛋白定位于病毒囊膜上，F蛋白的主要作用是在H蛋白协助下介导病毒囊膜与宿主细胞膜的融合。在共表达PPRV的F与H蛋白的Vero-DST细胞中，F蛋白和H蛋白也能诱导细胞间形成合胞体[11]。副黏病毒科的F蛋白首先在宿主内质网合成前体F0蛋白，然后在酶的作用下分解为由二硫键相连的F1和F2组成的功能性F蛋白。在PPRV通过出芽的方式被释放到细胞外时，H蛋白以及F蛋白有可能会残留在宿主细胞膜上，这些残留的蛋白会作为靶标诱导动物产生针对被感染细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)[12]。

L蛋白是PPRV中分子质量最大的蛋白，与P蛋白一起发挥RNA聚合酶活性，负责基因组RNA的转录与复制。L蛋白还能对病毒mRNA进行加帽、甲基化等加工修饰作用。近年的研究确定了L蛋白的RNA三磷酸酶(RTPase)活性的最小结构域，该区域位于L蛋白C末端，氨基酸位点1 640-1 840之间，这段区域依赖于镁离子或者锰离子发挥RTPase活性[13]。

1.2 小反刍兽疫病毒的分类

PPRV只有一个血清型，但根据F基因部分序列和N基因的序列可以进行遗传进化分析，其中N基因的分析能够按照地理来源将PPRV分类，F基因偏向于以时间轴反映PPRV的演化过程[14]。对N基因的部分序列分析，可以将PPRV在不同地区的分离株分为4个不同的谱系，其中谱系Ⅰ和谱系Ⅱ来自于西非，谱系Ⅲ来自于东非、阿拉伯和南印度，谱系Ⅳ来自于中东、印度等亚洲地区。

2 小反刍兽疫的流行情况

2.1 国内小反刍兽疫的流行现状

我国PPR的流行可以根据时间大致划分为三个阶段，分别为2007年-2013年、2013年-2014年以及2014年以后。2007年，在西藏阿里地区发现了国内首例PPR，在此之后的几年疫情通过混群混牧和引种等方式向东缓慢传播，并分别于2008年和2010年在西藏那曲和阿里地区暴发。2013年-2014年PPR在全国各地暴发，形成了一次大流行。2013年新疆伊犁发生PPR疫情，同年新疆哈密地区、阿克苏地区发生疫情。2014年1月至3月，甘肃、内蒙古、安徽和重庆等地依次暴发PPR疫情，总体表现为由西向东传播，到2014年4月，全国包括西藏、新疆、甘肃、内蒙古、宁夏、湖南、辽宁、江西、安徽、江苏和重庆等20个省、直辖市和自治区均有报告PPR疫情[15]。

近年来，PPR在我国呈散发流行。2015年-2020年，我国农业农村部通报的疫情一共5起，均发生于2018年和2020年。其中2020年的2起疫情均为输入性疫情，涉及新疆、辽宁、湖南、江苏和青海。PPRV除了在家畜中流行以外，也多次在野生动物中发现，2016年在新疆乌鲁木齐和库车的北山羊和鹅喉羚种群中发现PPRV感染，引起7只动物死亡[16]；2018年在甘肃发现了野生普氏原羚感染PPRV[17]；2019年在青海发现了野生岩羊感染PPRV[18]，这些野生动物感染的病例警示了PPRV有在国内形成自然疫源地的风险。2013年11月至2018年11月国内报道的PPR病例数为294例。Ma J[19]等将这段时期内的PPR病例划分为了三个时空相关的分布集群，分别为东北群、华东群和华南群，并且发现当地最干旱月份的降雨量会显著影响PPR暴发。

联合国粮农组织和世界动物卫生组织于2015年提出了至2030年全球范围内PPR根除计划，同年我国农业部也提出了至2020年国内PPR根除计划，按照计划，PPR被列入强制免疫疾病。近两年国内部分省市对PPRV的血清学监测结果显示，这些省市的羊场的PPRV血清免疫抗体阳性率普遍达到了国家规定的70%以上，部分地方如山东省[20]、江苏太仓市[21]、四川攀枝花市[22]等地区平均抗体阳性率达到了90%以上，全国仅有少数县市如安徽省芜湖市及淮南市[23]的部分羊场仍然未能达标。

2.2 世界范围内小反刍兽疫的分布和分子流行病学研究现状

PPRV在世界范围内主要分布于非洲、中东以及南亚地区，呈现由西向东扩散的趋势。从PPRV 4个谱系的流行区域来看，谱系Ⅰ主要分布于西非的科特迪瓦、塞内加尔和几内亚等国家；谱系Ⅱ主要分布于西非的加纳、尼日利亚、马里等国家；谱系Ⅲ主要分布于东非的埃塞俄比亚、苏丹、索马里等国家和阿拉伯半岛南部的阿曼和阿联酋等国家；谱系Ⅳ主要分布于北非的阿尔及利亚、埃及等国家、中东的土耳其、以色列、沙特阿拉伯等国家、南亚的印度、孟加拉等国家。我国流行的PPRV均为谱系Ⅳ，整个谱系Ⅳ又分为4个分支，分别是土耳其分支、非洲分支、印度分支和中国2013年-2017年分支。

在2014年PPR大暴发后，我国多个省市分离出了PPRV毒株。盛琰翔[24]对来自江苏、西藏、贵州等13个省份时间跨度从2013年-2017年的53株PPRV的全基因组和来自其他国家(地区)的16株代表性PPRV毒株的全基因组进行了遗传进化分析。结果显示，这段时期内我国的PPRV主要来自于谱系Ⅳ，并且与2007年西藏PPRV毒株同源性最高。根据王净等[25]的研究，2013年-2014年PPRV毒株与2007年西藏PPRV毒株又可以进一步划分到2个分支中。

3 小反刍兽疫的分子诊断

3.1 小反刍兽疫病毒各基因的检测研究现状

PPRV的6个基因的表达量、突变速度和突变程度各有不同。2014年-2017年，全国28个PPRV毒株中共出现518个核苷酸突变位点，有137个导致了氨基酸变异，其中L基因突变位点最多，M基因最为保守[24]。6个基因中，编码核衣壳蛋白的N蛋白是表达量最高的，虽然N蛋白不能诱导动物产生保护性抗体，但是由于N蛋白可以进行原核表达且表达量高能诱导动物产生大量抗体，是血清学检测最常用的抗原。在目前的分子检测中N基因也是最常用基因。F基因保守度较高，编码PPRV主要的保护性抗原，也可以作为PPRV检测的靶基因。M基因是PPRV中最为保守的基因，但是由于麻疹病毒属内该基因同源性较高，少用于PPRV的分子检测。H基因是PPRV主要保护性抗原基因之一，但是保守性低，在PPRV中突变速度最快，也少用于分子检测。关于针对L基因的检测方法目前尚未建立。

3.2 小反刍兽疫病毒的分子检测方法研究现状

RT-PCR和RT-qPCR是目前PPRV分子检测最常用的方法，已经报道的RT-PCR和RT-qPCR方法主要针对的靶基因为N、F基因。我国国家标准《小反刍兽疫诊断技术》中采用的PPRV分子检测方法为针对N基因的RT-PCR和RT-qPCR。Halecker S等[26]将磁珠提取RNA技术和RT-qPCR冻干试剂组合成了能够快速利用RT-qPCR检测PPRV的检测试剂盒，该试剂盒除了能在30 min～40 min内得出结果外，还能有效区分PPRV和其他麻疹病毒属病毒。朱小甫等[27]建立了针对F基因的RT-nPCR方法，相较于RT-PCR大大提高了检测的灵敏度。多项研究将各类等温检测技术如环介导等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(RPA)应用于小反刍兽疫病毒检测。这两种技术的优势在于检测速度快，检测条件要求低。Mahapatra M等[28]研发了针对PPRV的N基因的RT-LAMP检测技术，准确度与RT-qPCR相当，而且无需提取病料的RNA。徐滢等[29]使用SYBR GreenⅠ对PPRV的F基因RT-LAMP产物染色，建立了可视化的RT-LAMP检测方法，灵敏度高于传统的RT-PCR。Li Y L等[30]针对PPRV的N基因开发了实时RT-RPA检测方法，与RT-qPCR灵敏度和特异性相当，但更加简便快捷。将PPRV的检测与其他常见病原的检测集成为多重检测体系也是研究热点。霍晓丽等[31]建立了绵羊肺炎支原体与PPRV的双重RT-PCR检测方法；范晴等[32]建立了蓝舌病毒与PPRV的双重RT-LAMP检测方法、王璐瑶等[33]建立了山羊痘病毒与PPRV的双重PCR检测方法。随着更多前沿的分子检测技术的应用，PPRV的分子检测正向着快速化、高通量化发展。

4 展望

由于PPR带来的损失巨大，且PPRV在自然环境下难以生存且需要密切接触传播，而且PPR减毒活疫苗能够提供针对所有毒株的长期保护，具备被根除的条件，我国农业部于2015年底制定了全国PPR消灭计划。该计划目标为到2020年，除毗邻PPR疫情国家的陆地边境县(团场)或沿边境线30 km范围内的免疫隔离带以外，力争达到全国非免疫无疫区标准。自2018年以后我国没有再出现过本土PPR病例，直到2021年我国已经完成了全国消灭小反刍兽疫的任务。OIE和FAO也于2016年宣布了全球根除PPR计划，计划于2030年前在世界范围内根除PPR。目前世界范围内PPR根除计划面临的主要问题为PPR大多流行于非洲和南亚地区的欠发达国家，没有足够的资金和技术支持PPR根除计划。此外，过去曾经认为野生动物在PPR传播中没有流行病学意义，但是越来越多的研究表明濒危野生动物不但会受到PPRV威胁，而且在PPRV的传播中有重要意义[34]。除了我国多次在野生动物中检测到PPRV以外，近年来我国周边邻国也有在野生动物中发现PPRV的报道，2016年-2017年蒙古国赛加羚羊等野生有蹄类种群就暴发了一次谱系Ⅳ PPRV引起的PPR疫情[35]。要完成全球范围内根除PPR的计划，首先是需要进一步研究PPRV在野生动物中的传播机制，防止自然疫源地的形成；其次是需要研发在欠发达国家或者野外环境下能够使用的、稳定准确廉价易操作的PPRV检测方法；已经控制和消灭PPR的国家和地区要加强境外输入的防控，仍在流行的国家和地区要推进疫苗和快速检测技术的推广。

我国在2020年以及2021年初西北地区仍然发生了输入型的PPR。输入型PPR病例的发生与我国周边，尤其是西南邻国如印度、孟加拉国等国家的PPR持续流行密切相关。从这些国家进口的动物制品或者活体动物有输入PPRV的风险，野生动物的迁徙也会带来潜在的PPRV输入风险。分子流行病学研究也证明了我国曾流行的PPRV毒株与这些国家的PPRV毒株有密切的关系。鉴于我国各地养羊场的PPR抗体阳性普遍达标，且周边国家的PPR疫情仍然十分严峻的情况，为了在我国消灭PPR，目前我国PPR的预防与清除措施除了继续保持羊群的免疫接种以外，重点应放在防止感染动物从境外输入。目前带毒动物的输入途径主要为带毒的野生动物越境与家畜接触和进口带毒家畜。除了加强边境地区的畜群管理和野生动物迁徙监控以外，海关等检疫机构需要加强对PPRV的检测力度。研发更加方便快捷的PPRV检测手段对于海关、检疫站以及养殖场动物引进检疫都有重要的意义。整合PPR与其他羊常见疾病的综合检测方法目前还有待继续研究开发。多种日益成熟的新型检测技术都有应用于PPRV检测的潜力，如基于各种等温扩增技术和微流控技术开发的微流控芯片技术、基于CRISPR/Cas13a的SHERLOCK检测技术等。结合各类新型技术开发小型化、快速化、简便化、高通量化和数字化的PPRV检测方法是未来PPRV分子检测的发展方向。