陈晗璐, 吴盛海
(1. 浙江中医药大学第四临床医学院,浙江 杭州 310006;2. 浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院检验科,浙江 杭州 310006)
血流感染是指病原微生物侵入血流引起的播散感染,可造成感染性心内膜炎、感染性休克、播散性血管内凝血等严重的临床后果,病死率高。血培养作为诊断血流感染的金标准,可以鉴定病原体,并提供抗菌药物敏感性试验结果,对指导临床医生进行抗感染治疗意义重大。随着自动化细菌培养系统的引入,血培养的价值逐渐得到临床的广泛认可。然而,血培养的阳性率并不高,有相当比例的血流感染患者血培养结果呈阴性[1]。有学者对住院患者的血培养结果进行统计,发现血培养阳性率仅为8.37%~12.51%[2-3]。采血前使用抗菌药物、苛养菌本身生长缓慢且对营养要求较高,以及一些胞内寄生菌的感染等均可导致血培养结果呈阴性。血清学试验、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和下一代测序(nextgeneration sequencing,NGS)等分子生物学技术的使用,是血流感染病原学实验室诊断的有效补充。
分析前因素指血培养样本在送达微生物实验室前,对血培养结果有影响的所有因素,包括行血培养的临床适应症,血培养样本的采集时间和采集过程中皮肤的准备和污染的预防,以及采集时血培养瓶的套数和采血量等。
1.1.1 抗菌药物的使用 采血前使用抗菌药物是降低血培养阳性率的独立影响因素[4-5]。德国1项针对脓毒症患者的前瞻性临床队列研究发现,未接受抗菌药物治疗的脓毒症患者血培养阳性率为50.6%(78/154),已接受抗菌药物治疗的患者血培养阳性率仅为27.7%(112/405)[5]。美国1项对行血培养的住院患者进行的前瞻性队列研究发现,普通住院患者的血培养真阳性率远低于急诊科和重症监护病房患者的血培养真阳性率,培养前72 h内无抗菌药物暴露可以有效提高菌血症和心内膜炎患者血培养阳性率[6]。虽然脓毒症患者在进行抗感染治疗前进行血培养有利于病原体的检出,但鉴于早期广谱抗菌药物的使用可以有效降低脓毒症患者的病死率和预防感染性休克,以及部分医院试验条件的限制,临床医生往往会优先考虑早期抗感染治疗,而不是进行血培养。
1.1.2 采血量不足 采集足量的血液样本进行血培养对血流感染病原体的检出至关重要,采血量越大,血培养阳性率越高,血流感染的诊断率也就越高。1项评估了345例脓毒症患者血培养采血量及其结果的研究发现,每多采集1 mL血液,血培养的阳性率可增加1%[7]。相关机构建议的采血量为每瓶8~10 mL,但在实际操作中常难以达到[7]。采血相关培训的缺乏、重症或婴幼儿患者采血困难等因素均可导致血培养采血量不足[8]。一般情况下,实验室通常采取目测的方式评估采血量,但这不适用于样本量较大的微生物实验室,因此有研究建议通过测量血培养瓶的重量来评估采血量,以提高血流感染的诊断效率[8]。
1.1.3 血培养样本延迟上机 目前,绝大部分实验室是采用全自动仪器进行血培养监测,血培养样本延迟上机与血培养阳性率降低密切相关。相关指南[9]建议血培养样本从采集到进入自动血液培养系统的时间不应超过2~4 h,制造商也提出接种的血培养瓶应该尽快运送至实验室处理。然而,大多实验室无法提供24 h服务,工作时间以外采集的血培养样本在进入微生物实验室之前通常会在室温下储存较长时间。意大利1项大型的回顾性研究发现,在工作时间采集并处理的血液样本血培养阳性率为13.0%,而在实验室关闭期间采集并延迟上机的血液样本中,只有10.8%的血培养结果呈阳性,且样本采集到上机的时间每延长1 h,血培养阳性率会下降0.3%[9]。
目前,在接种量及接种方式符合要求的情况下,自动化血培养系统已经能够分离大多数可以生长的病原体,但HACEK(Haemophilus,Actinomyces,Cardiobacterium,Eikenella,Kingella)菌群、营养变异链球菌(Nutritionally Variant Streptococcus)、念珠菌等生长极为缓慢的苛养微生物,仍是引起血培养结果呈阴性的重要病原微生物。这些病原侵入血流可引起病程缓慢、临床症状不典型的血流感染,引发血培养阴性感染性心内膜炎(blood culture-negative endocarditis,BCNE)[10]。
1.2.1 HACEK菌群 HACEK是一组由嗜血杆菌属、放线杆菌属、心杆菌属、艾肯菌属和金杆菌属组成的革兰阴性杆菌群,可在人口咽和上呼吸道定植,在一定条件下可引起菌血症和感染性心内膜炎(infective endocarditis,IE)。但流感嗜血杆菌很少从IE患者的血液样本中被培养出来,通常被排除在HACEK菌群之外[11]。瑞典1项针对菌血症患者的回顾性研究结果显示,每年因HACEK引起的菌血症和IE的发病率分别为5.2例/百万和1.2例/百万[12]。在丹麦,HACEK引起的IE占此类病例的1.4%~3.0%,其中嗜血杆菌属感染最为常见,其次是放线杆菌和金氏杆菌感染,年发病率分别为0.16例/10万、0.11例/10万和0.08例/10万[11]。适当延长血培养时间可增加HACEK的检出率,在需氧条件下进行血培养,HACEK通常可在5 d内被检测到,继续延长血培养时间至>5 d并无太大意义[10,13]。传统的培养方法对HACEK菌群的鉴定具有不确定性,采用PCR检测血液样本中的细菌需要设计针对各个种属的特异性引物,而对16S rRNA基因扩增后进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析,可以在没有特异性引物的情况下鉴定每种HACEK细菌,16S rRNA测序也是鉴定HACEK细菌的可靠方法,但受到成本和设备可用性的限制[14]。
1.2.2 营养变异链球菌 营养变异链球菌是一组兼性厌氧细菌,包括孪生球菌、颗粒球菌、毗邻贫养菌,是人类口腔、生殖道、泌尿道和肠道正常菌群的一部分,一定条件下可侵入机体引起菌血症和IE。营养变异链球菌感染在链球菌感染相关的IE病例中约占3%~5%,与其他链球菌相比,营养变异链球菌引起的IE临床病程缓慢,且具有更高的病死率[15]。龋齿是营养变异链球菌进入血流的主要途径,患者通常在发现几个月前行牙科治疗或发生龋齿[10]。营养变异链球菌的传代培养需要在琼脂中补充维生素B6或半胱氨酸,亦可在血琼脂平板上点种金黄色葡萄球菌来支持其生长[16]。
1项回顾了12年中26例营养变异链球菌菌血症病例的研究结果显示,血培养报告阳性的时间为2~11 d,其中有7例报阳时间>5 d,超过大部分微生物实验室进行常规血培养的时间,因此可以合理推测有其他BCNE或脓毒症患者感染了该病原,建议实验室将临床医生高度怀疑为IE患者的血培养时间延长至10 d[17]。PCR-RFLP分析、16S rRNA测序等分子技术对鉴定营养变异链球菌也非常有意义,且对于BCNE,离体心脏瓣膜病原体靶基因检测的敏感性远高于常规血培养[15]。
1.2.3 念珠菌 随着移植手术的免疫抑制治疗、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染、恶性血液病和癌症等患者的增多,非致病真菌感染已成为一个严重的问题[18]。值得注意的是,尽管白念珠菌仍然是引起侵入性真菌感染最常见的菌种,但非白念珠菌感染的比例正逐渐上升。中国医院侵入性真菌监测网(China Hospital Invasive Fungal Surveillance Net,CHIF-NET)的5年监测结果显示,念珠菌菌血症最常见的菌种是白念珠菌(32.3%),以下依次为近平滑念珠菌(28.9%)、热带念珠菌(17.5%)和光滑念珠菌(11.5%)[19]。
真菌感染的临床诊断通常依靠培养和组织病理学检查。由于血培养对血源播散性念珠菌病的敏感性<50%,且念珠菌生长缓慢,念珠菌病的治疗常常会被延迟[14]。分子生物学技术可以为血培养结果为阴性的患者提供有价值的补充诊断信息,有研究利用泛真菌引物扩增18S rRNA基因的转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS),在100个血培养阴性样本中检出3个阳性结果[18]。
伯纳特立克次体(Coxiella Burnetii)、巴尔通体(Bartonella)和惠普尔滋养体(Tropheryma whipplei)是“真正的”血培养阴性病原体,现有的血培养技术尚不能对其进行常规培养和鉴定。有研究结果显示,在引起真正BCNE的病原体中,伯纳特立克次体占28%~37%,巴尔通体占12%~28%,惠普尔滋养体占6%,且都与特定的危险因素暴露或接触史有关[20]。
1.3.1 伯纳特立克次体 伯纳特立克次体是引起Q热的病原,该菌为细胞内寄生,在真核细胞中复制,体外细胞培养中的倍增时间为20~45 h[21-22]。伯纳特立克次体感染范围广泛,从节肢动物到人类均可感染。家养反刍动物是其主要宿主,也是人类暴发疫情的主要传染源。人类最常见的感染原因是吸入了感染动物在分娩或流产后产生的细菌气溶胶,直接接触受感染动物的胎盘、流产物和皮毛、粪便等也可能被感染。值得注意的是,因为该菌能在土壤中存活很长一段时间,且气溶胶至少可以被风输送30 km,可造成远离主要受污染地区的Q热,所以也可以造成近期没有动物接触史的人感染[21]。伯纳特立克次体在实验室常规培养技术下不能生长,当出现提示Q热症状时,血清学检测是一线诊断方法,主要检测方法有间接免疫荧光试验、补体固定试验、酶联免疫吸附试验[21-22]。目前,基于PCR的检测方法也已被应用于临床样本中伯纳特立克次体的检测。
1.3.2 巴尔通体 巴尔通体是一种细小的细胞内革兰阴性细菌,在免疫功能良好或免疫功能低下的宿主中均可引起感染[22]。该菌侵入红细胞可以逃避免疫反应,在宿主红细胞内持续存活导致菌血症,是巴尔通体感染的特征之一。有研究结果显示,这种菌血症往往是低水平的,可持续数月,甚至数年,没有或只有亚临床症状,最终可发展为IE,但这一结论尚未得到流行病学或实验数据的验证[4]。汉塞巴尔通体(Bartonella henselae)通常感染家猫和野猫,通过猫抓、咬或猫蚤传播给人类,在感染HIV的患者中常会引起猫抓病、细菌性血管瘤和肝脂肪瘤。金氏巴尔通体(Bartonella quintana)则通过人虱传播,引起战壕热、发热性淋巴结病和细菌性血管瘤。金氏巴尔通体和汉塞巴尔通体是巴尔通体引起IE的2个常见菌种[4,22]。
巴尔通体感染的血培养结果通常为阴性,需要结合血清学、PCR、DNA测序和切除的心脏瓣膜组织的病理学检查进行诊断。瓣膜组织巴尔通体DNA的PCR扩增对于巴尔通体心内膜炎诊断具有重要意义,有较高的敏感性和特异性;PCR检测也可以采用全血、血浆或血清样本进行,敏感性为58%,特异性为100%[4]。
1.3.3 惠普尔滋养体 惠普尔滋养体感染可引起一种不常见的慢性全身性疾病——惠普尔病(Whipple's disease),其早期表现为多关节炎、体质量减轻、贫血,随后是腹痛、腹泻和恶病质,体格检查常发现淋巴结病变和色素沉着。惠普尔滋养体感染可导致BCNE,多见于男性患者;因惠普尔滋养体种系与土壤细菌相近,有学者怀疑人类经口腔途径感染惠普尔滋养体[23-24]。有研究结果显示,健康人的胃液、唾液以及污水样本中均可检测到此菌的DNA[24]。因此,惠普尔滋养体可能存在于相当一部分人群中,但不会导致其患病,其PCR检测结果需与临床症状和当地流行病学资料相结合来解释[24]。
传统的血培养是将采集的血液样本注入血培养瓶内,通过自动血培养仪进行增菌培养,当仪器监测到培养瓶内有微生物生长时,会发出报警提示,大部分阳性样本会在3 d内报阳,实验室技术人员将报阳样本涂片行革兰染色镜检,将镜检结果作为危急值报告给临床医生,同时转种固体培养平板,大概需要24 h生长出纯的单克隆菌落,以区分单一感染和混合感染,然后进行常规生化鉴定和药物敏感性试验,10~18 h获得最终鉴定和药物敏感性试验结果。所以,从采集血培养样本到发出报告,往往需要3~5 d时间。
为了缩短样本周转时间,尽早得到鉴定和体外药物敏感性试验结果,实验室一般会通过富集阳性血培养瓶中的病原体,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)和荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)进行细菌鉴定。MALDI-TOF MS用于病原菌鉴定在我国各级医疗机构临床微生物实验室已广泛开发,但对混合感染的鉴定仍存在困难[25]。PNA-FISH通过模拟DNA探针与病原内的16S rRNA序列和酵母菌内的18S rRNA序列进行快速、特异的杂交,用于鉴定最常见的革兰阳性菌、革兰阴性菌和念珠菌。因可用的PNA-FISH探针数量有限,且富集的菌量至少为105CFU/mL,限制了其临床使用[26]。Accelerate Pheno系统使用自动样品制备和细菌固定化方法,以显微镜镜检为基础,利用FISH探针进行单细胞分析来进行细菌鉴定和药物敏感性试验,已经通过美国食品药品监督管理局认证,并在欧美等国家应用[27]。
上述新技术的使用缩短了样本周转时间,在一定程度上提高了血培养的临床应用价值,但前提必须是血培养阳性。对于血培养阴性的样本,目前只能依赖血清学和分子生物学技术进行检测。
血清抗体检测是诊断感染的经典方法,急性期和恢复期血清抗体滴度呈4倍及以上上升是诊断感染的金标准[16]。在血培养结果呈阴性的情况下,血清学抗体检测是感染诊断的有效补充。2项评估BCNE血清学检测的研究结果显示,1 093例患者中有624例可通过血清学检测诊断[20]。有研究结果显示,当存在危险因素(生活在流行地区、职业接触、食用未经巴氏杀菌的乳制品)暴露时,可增加布鲁菌病血清学检测[10],但不建议对军团菌、支原体和衣原体常规进行血清学检测[20]。
人感染伯纳特立克次体时,免疫反应会诱导机体产生Ⅰ相抗体和Ⅱ相抗体。Ⅱ相抗体可在临床症状出现后7~15 d被检测到,在3~6个月内下降,检测间隔3~6周采集的2份血清样本的Ⅱ相抗体滴度IgG或IgM增长4倍以上可诊断为原发性感染,Ⅱ相抗体滴度IgG≥200和/或IgM≥50对原发性感染亦有重要的诊断价值。Ⅰ相抗体滴度IgG≥800则与慢性Q热有关,且与伯纳特立克次体IE阳性预测值高度相关[21]。然而,1项比较了来自英国、法国和澳大利亚的3个医疗机构Q热病例血清学检测结果的研究发现,3个医疗机构对结果判读的一致性只有35%[21]。这反映了血清学虽然是伯纳特立克次体病原体的首要诊断技术,但因其解释的主观性,尚无法形成统一的判定标准。
巴尔通体也可通过血清学方法诊断,抗体滴度>800提示与IE相关,阳性预测值为95%,但抗体滴度<800并不能排除心内膜炎[16]。值得注意的是,衣原体和巴尔通体存在交叉反应,当血清学诊断怀疑衣原体感染时,应重新评估以排除巴尔通体感染[10,16]。
鉴于病原体培养成本高、产量低和周转慢的特点,全血样本核酸扩增成为血培养方法的有益补充,可以检测血培养遗漏的微生物,并缩短病原鉴定的时间,有较大的临床价值。然而由于其高敏感性和可能存在的污染风险,应谨慎解释阳性结果,且检测结果需与临床诊断相符[28-29]。
病原16S rRNA检测可作为临床怀疑血流感染,但血培养阴性患者的补充检查。有学者利用16S rRNA检测101例重症患者血液样本,检出了血培养遗漏的至少6个阳性结果,比使用常规血培养更为敏感[30]。由于采用的是16S rRNA通用扩增引物,病原体不能被鉴定到种,须使用特定细菌的特异性引物来进一步鉴定可疑的病原微生物[20]。有研究用质谱技术测定每个PCR扩增片段的质量,计算核苷酸碱基组成,并与数据库进行比对,实现了病原菌的鉴定,这种广谱PCR和电喷雾电离串联质谱(electrospray ionization tandem mass spectrometry,ESI-MS)相结合的方法可以完成病原微生物的鉴定[31]。1项回顾性研究结果显示,PCR/ESI-MS与血培养结果的符合率为85.7%[32]。
实时PCR是在PCR反应体系中加入荧光标记探针,利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。有研究结果显示,实时PCR使BCNE患者血液中病原体的诊断效率提高了24.3%,新检出的病原体主要包括肠球菌、链球菌、人型支原体和惠普尔滋养体[28]。
以IS1111为靶点的特异性实时荧光PCR被认为是临床样本中伯纳特立克次体最敏感的检测方法,可在感染伯纳特立克次体2周内、血清抗体尚未呈阳性时检出患者血液中的伯纳特立克次体。另外,采用冻干法浓缩从临床样本中提取的DNA,能够进一步提高该检测方法的敏感性,在原发性Q热患者中,冻干法处理可使实时荧光PCR对血清学检测阴性样本的敏感性提高44%,对早期血清学检测阳性样本的敏感性提高30%[21]。
多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR,是在同一PCR反应体系加入2对以上的引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR技术。
FilmArray系统采用巢式多重PCR技术,集样品制备、扩增、检测和分析于一体。可检测血流感染相关的24种病原体靶标和3种抗菌药物耐药基因,虽然目前大部分相关研究集中在对于血培养瓶报阳后的检测,但对血培养阴性的样本,仍有一定的实用价值[33]。由于巢式PCR的高灵敏性,不能排除环境或血液样本中存在病原体核酸而出现假阳性结果。曾经出现的肠球菌和铜绿假单胞菌假阳性结果,以及目前依旧存在的变形杆菌假阳性问题,均提示巢式PCR扩增阳性血培养液核酸靶标的局限性[34]。美国食品药品监督管理局于2017年批准了相对较新的革兰阳性球菌iCubate系统(IC-GPC),该系统是基于荧光信号检测的多重PCR和微阵列杂交,除肺炎链球菌外,所有目标菌鉴定和耐药基因检测的敏感性和特异性均>95%[34]。
基于PCR的检测方法通常需要一定程度的先验信息,但这些信息并不总是存在。对于未知样本或新的病原体,无偏移的DNA测序显然更高效。传统的测序方法不适用于混合物的分析,且成本高、耗时长,而NGS不仅能以高灵敏度和高通量对异质混合的遗传物质进行测序,还能同时获取药物敏感性信息,为在没有任何先验信息情况下进行全面的病原体检测带来了希望。然而全血样本中病原体DNA的含量通常较低,宿主DNA与病原体DNA的比值常高达108∶1,因此将NGS直接应用于全血样本的病原体检测仍具有挑战性。近期有研究报道了快速消耗全血样本中的人类DNA,并使细菌DNA富集的方法,使菌血症的快速诊断成为可能[35]。
机体屏障功能的完整性受到破坏和机体免疫力下降均是导致血流感染发生的危险因素,血流感染引起的脓毒症是住院患者死亡的主要原因之一。通过持续监测患者的临床症状、生命体征、白细胞计数、C反应蛋白水平和降钙素原水平等,可初步判断是否发生血流感染。但进行血培养获得病原体信息依旧是诊断细菌性血流感染最重要的证据,也可以为临床抗感染治疗提供药物敏感性试验结果。
目前,在诊断血流感染以及进行后续抗感染治疗过程中依旧存在诸多问题。(1)感染的诊断是否成立。由于手术、药物、肿瘤以及自身免疫性疾病都会引发与血流感染类似的症状和体征,所以获得明确的病原体信息显得尤为重要,但能够明确病原体并不是一件容易的事情,目前进行的常规血培养阳性率不足20%,所以很多学者在探索如何进一步提高阳性病原的检出率。(2)提供靶向抗感染治疗信息的及时性。早期、足量的靶向抗感染治疗不仅能改善患者预后,降低病死率,也可以减少患者住院时间和医疗成本。但进行体外药物敏感性试验必须采用活的病原体,而病原体的生长需要一定的周期,所以很多学者在探索如何富集足量的细菌来进行早期的体外药物敏感试验,以提示临床进行早期的干预治疗[25]。(3)由于血流感染的诊断和治疗涉及到机体、病原和抗感染药物使用等方面,且目前采用的诊断技术或多或少存在一定的局限性,有必要进行不断的探索和优化,包括质谱技术、NGS的应用指征及结果解释。
除上述主流技术外,基于快速声学分离和富集的微芯片PCR检测系统[36]、基于无标记抗体微阵列的离子共振成像系统[37]、基于大小识别而无标记的弹性惯性微流控技术[38],以及T2磁共振技术等[34]快速检测血液中病原微生物的新技术给血流感染的快速病原学诊断带来了新的希望。T2磁共振技术是将病原体特异性DNA进行PCR扩增,然后将扩增产物与探针修饰的超顺磁性纳米颗粒杂交,杂交后会使纳米颗粒聚集,通过T2MR诱导检测信号的变化来检测目的片段。为提高血流感染的诊断效率,在致力于开发、优化更为有效的技术的同时,也需进一步对感染的发生、发展,以及体内播散机制进行研究与探索。