线粒体DNA 1555 A>G导致遗传性耳聋的临床特征及生殖干预研究进展

高宗石 纪冬梅

线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)1555 A>G(m.1555 A>G)突变是导致非综合征性耳聋的一大遗传因素，该突变会造成线粒体12S rRNA亚基的结构异常，使突变携带者对氨基糖苷类药物的敏感性提高，常表现出不可逆的听力损失，为患者及其家庭造成严重疾病负担。近年来许多国内外学者致力于探索m.1555 A>G突变的治病机制和临床特征，并着力于预防此类线粒体遗传病在家系中的垂直传递，产前诊断、胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)及线粒体置换技术(mitochondrial replacement techniques，MRT)对阻断突变mtDNA遗传有一定的作用，但是对预防m.1555 A>G突变传递的价值尚不明确。本文通过分析m.1555 A>G突变的临床特征和生殖遗传干预技术新进展，旨在为携带该突变的女性提供孕前咨询与生育指导，降低耳聋患儿出生率。

1 遗传性非综合征性耳聋

耳聋是最常见的感官缺陷疾病之一，在新生儿中的发病率约为1‰～3‰，根据不同的病变部位耳聋可分为传导性聋、感音神经性聋和混合性聋，根据不同的发病时间可分为语前聋和语后聋。据统计约50%的患者其耳聋症状由遗传因素所导致，这其中约70%的患者为非综合征性耳聋(non-syndromic hearing impairment，NSHI)[1-2]，即听力损失不伴随其它临床症状。由于听力机制的复杂性，截至2021年8月，已确定了124个导致非综合征性耳聋的核基因，这其中包括51个导致常染色体显性遗传的基因，78个导致常染色体隐性遗传的基因和5个X-连锁非综合征性耳聋基因(https://hereditaryhearingloss.org/)，另外还有两个线粒体基因与NSHL有关[3]。在我国，常见的耳聋突变热点有GJB2基因235 delC和299-300 delAT，SLC 26 A4基因IVS 7-2 A>G和2168 A>G，以及mtDNA上的1555 A>G、1449 C>T[4]。

2 线粒体基因组遗传特点

线粒体是存在于大多数真核细胞中的一类具有双层膜结构的半自主细胞器，拥有独立的遗传物质即mtDNA。人类线粒体遗传物质mtDNA是一个含有16 569个碱基对的双链环状分子，编码2种rRNA、22种tRNA以及13种多肽，由于氧化损伤和缺乏保护性组蛋白，线粒体基因组的突变率远高于核DNA[5]。mtDNA突变与多种人类疾病相关，了解其遗传特点，对监测和预防相关遗传病的发生有重要意义。

与核基因组遵循孟德尔遗传规律不同，mtDNA有自身独特的遗传特点：①母系遗传。受精卵形成过程中，由于精子中几乎不含mtDNA，来自卵母细胞胞质的mtDNA在遗传中占有绝对优势，所以只有母亲的线粒体疾病可遗传给子女；②异质性。野生型和突变型mtDNA可共存在于同一个体的细胞、组织中，共同影响表型，即一种性状可以由多个不同的基因控制。通常所有的mtDNA分子都是相同的，即为同质性，当遇到野生型和突变型mtDNA的混合物时，才会导致异质性；③遗传瓶颈。人类每个卵细胞中约有10万个mtDNA，在卵母细胞成熟时，绝大多数mtDNA会丧失，只有大约10～100个mtDNA会被保留并传递给子代，这种卵母细胞形成期mtDNA数量剧减造成了子代个体间的异质性差异；④复制分离。在有丝分裂和减数分裂中，突变型和野生型mtDNA随机地分配到子细胞中，使子细胞间突变型mtDNA分子的比例存在差异；⑤阈值效应。mtDNA突变者的表型由野生型和突变型mtDNA的数量比例及该组织对能量的依赖程度决定，能引起组织和器官功能障碍的mtDNA最小突变水平称为阈值。当突变mtDNA数量超过此阈值时，野生型mtDNA不足以弥补突变mtDNA产生的缺陷，无法满足该处组织、器官对能量和物质的最低需求，造成功能异常，产生相应的表型，反之低于此阈值不会出现相应的临床症状。

3 m.1555A>G致病机制

线粒体rRNA 1555位于12S rRNA的高度保守区域，由茎环结构将此处的两股保守核苷酸序列分开，是氨基酰-tRNA结合位点的一部分，对核糖体小亚基翻译过程中解码起重要作用。既往研究发现，m.1555 A>G突变使12S rRNA与相邻核苷酸序列上的1 494位点C碱基形成了一个新的C-G碱基对[6]，使其二级结构接近大肠杆菌16SrRNA，在大肠杆菌中rRNA易与氨基糖苷结合并阻碍蛋白质的合成[7]，因此可推测线粒体1555 A>G突变为氨基糖苷的结合提供了新的位点，抑制核糖体蛋白合成从而造成耳蜗毛细胞的损伤。随着耳聋家系检测的普及，越来越多案例发现即使不接触氨基糖苷类药物，m.1555 A>G突变携带者也可能于发生听力损失，说明该突变还可能存在其他致病途径[8]。

Bravo等[9]对筛查出的m.1555 A>G突变携带者进行了畸变产物耳声发射(distortion products of otoacoustic emissions,DPOAE)和听觉脑干反应(auditory brainstem responses,ABR)检测，所有受试者均有对称的ABR记录，Ⅰ波潜伏期延长，波间潜伏期保留，表明耳蜗功能障碍，听觉神经没有受到影响，因此认为1555 A>G突变相关的听力损失是由于核糖体内线粒体翻译缺陷导致 ATP产生减少，活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生增加，进而毛细胞凋亡导致耳蜗缺陷。Cortopassi等[10]则提出，线粒体功能障碍可抑制毛细胞和血管纹中离子泵的ATP供给，导致耳蜗内离子浓度失衡从而促使毛细胞死亡，而氨基糖苷类药物可加强这一抑制效果，对毛细胞有间接毒性作用。

近年来随着动物研究实验的发展，人们对m.1555 A>G突变的致病机制也有了新的认识，在Raimundo等[11]的小鼠线粒体疾病模型中，甲基转移酶mtTFB1的超表达引起12SrRNA高甲基化，通过依赖AMP依赖的蛋白激酶(AMP-dependent protein kinase,AMPK)通路激活了促凋亡转录因子E2F1，引起导致耳蜗细胞凋亡，产生了与人类m.1555 A>G突变类似的听力损失症状；并且在m.1555 A>G突变的细胞培养中发现由呼吸链障碍导致的ROS增多和线粒体核糖体甲基化升高，ROS依赖型AMP激酶和促凋亡转录因子E2F1被激活，可见m.1555 A>G突变部分通过甲基转移酶mtTFB1使线粒体12S rRNA甲基化增加破坏线粒体核糖体功能。

众多家系调查发现携带m.1555 A>G突变的不同家庭成员中听力损失外显率和表型表达存在巨大差异，表明除了m.1555 A>G突变外，其他因素如核基因、环境影响、线粒体单倍型等因素也参与调控m.1555 A>G突变表型有关[12-13]。

4 线粒体DNA1555A>G临床特点与人群分布

4.1 临床特点 大多数m.1555 A>G突变患者表现出双侧对称性感音神经性听力损失，在高频率声音中症状表现更加严重，多伴有永久性耳鸣[9]。发病年龄常见于青年和成年阶段，不管是否有氨基糖苷用药史，发病年龄与听力损失程度之间皆存在负相关，发病年龄越小，听力损失程度越严重[14]，听力损失过程呈现明显的渐进性和家族聚集性，符合线粒体遗传病母系遗传的特点，然而m.1555 A>G突变的临床表型在不同家族间或者同一家族内的不同母性亲属之间存在着差异，从严重的语前听力损失到中度进行性迟发性听力损失，甚至某些个体根本没有听力损失。这种表型差异可以用线粒体疾病的阈值效应来解释，在有着高氧化磷酸化需求的耳蜗细胞中，当线粒体蛋白质合成率下降超过其阈值时，能量输出和蛋白质生成不能满足细胞、组织和器官正常功能的最低要求，便会产生相应的临床症状。部分患者随着年龄增长，m.1555 A>G突变所占比例增加，突变积累会导致耳聋症状加重。

氨基糖苷作为一种环境因素可与rRNA 1555 A>G突变结合使线粒体蛋白合成率额外降低30%[15]，使m.1555 A>G突变患者的耳聋程度加重。通常在接触基糖苷后三个月内出现第一次听力损失症状，听力损失的过程同样呈渐进性，但耳聋发生率及严重程度与接触氨基糖苷的年龄无关。无氨基糖苷接触史的突变携带者更倾向于发生轻度听力损失或无症状，发病年龄相比氨基糖苷接触者更迟，约80%在65岁前出现耳聋。在少数患者中，m.1555 A>G突变相关的线粒体异常还可诱发耳蜗以外组织的线粒体功能障碍，如肌肉细胞线粒体形态改变与功能障碍、肌纤维呈虫蛀状、细胞色素C氧化酶活性降低等[16]。

4.2 人群分布 m.1555 A>G突变最早在一个阿拉伯-以色列家庭中被发现[17]，随后在欧洲、亚洲、美洲和非洲的不同种族群体中被发现，东亚人群该突变的人数和比例显著高于其它地区[18]，这种区域差异可能与氨基糖苷类药物在亚洲的高使用量有关，也可能是由于不同人种的线粒体单倍群影响了外显率和表型[13]。调查显示，我国m.1555 A>G突变人数占世界该突变总人数的72．6%[14]，综合分析国内26个关于m.1555 A>G突变的调查发现，非综合征性耳聋患者的综合突变频率为5.21%，国内不同地域间m.1555A>G突变数占非综合征性耳聋患者总数的比例也有很大差别，西部地区显著高于东部地区，在检出率低的一些省市甚至未发现该突变个体[4, 19]。然而各个地区突变检出率受到很多外在因素的影响，想要更加客观地了解该突变在不同人群中更准确的发生频率，需要更加普及的检测手段，覆盖更大范围的患病人群以及统一的衡量标准。

4.3 异质性与临床症状的关系 早期m.1555 A>G突变基本都是在同质性患者中被发现，但中性多态性的同质性mtDNA突变无法解释表型异质性的问题，1997年El-Schahawi[20]首次在一个西班牙家系中发现了m.1555 A>G异质性突变；随后在另外六个西班牙耳聋家系的调查中显示m.1555A>G异质性突变个体的异质性程度与表型显著相关[21]，突变负荷少于20%的患者无症状或表现出轻度听力损失，突变负荷超过52%的患者表现出中度至重度听力损失。国内对m.1555 A>G异质性与临床表型的调查尚且较少，2007年欧启水等[22]在福建省的47例m.1555 A>G突变者中发现了28例同质性突变个体和19 例异质性突变个体，证实了中国人群中m.1555 A>G突变性质也分为同质性和异质性两种。程祖健等[23]通过定量检测m.1555 A>G突变携带者突变型、野生型的拷贝数，发现无论在散发组还是在家系组，异质性突变m.1555 A>G拷贝数均与听力损失严重程度都呈正相关；同质性突变m.1555 A>G拷贝数与听力损失程度在家系组呈类似的相关性，而在散发组，突变拷贝数都与听力损失程度无相关性，其原因可能是散发组患者的遗传背景、个体差异等有着较大差别，同质性mtDNA突变型拷贝数不能决定耳聋的严重程度。沈姗姗等[24]在一个来自陕西的m.1555 A>G突变家系调查中发现了10例m.1555 A>G突变携带者，突变负荷介于11.9%到97.9%不等，突变负荷与耳聋程度之间有很强的相关性，这与先前欧洲的调查结果一致；此外，子代异质性水平随母亲育龄的增加而降低，母亲突变负荷>70%时，其子代均表现出同质性突变，而母亲突变负荷<50%时，子代表现出更低的异质性水平。关于突变异质性在遗传过程中发生的变化还需进行更大规模调查分析。

5 遗传咨询与生殖干预

5.1 产前诊断 对于m.1555A>G以及类似由于基因突变导致的遗传性耳聋，后天治疗难以达到理想的效果，最有效的解决方法就是推广热点基因突变的筛查，对高风险人群提供孕期产前诊断和生育指导，避免遗传性耳聋患儿的出生，从而降低该突变在人群中的携带率。

产前诊断是在孕16～22周通过羊膜腔穿刺术获取羊水，或者在孕早期通过绒毛膜绒毛取材(chorionic villus sampling,CVS)抽取少量绒毛，以这类产前样本的突变负荷预测胎儿出生后受到突变基因影响并产生相应表型的风险。由于m.1555 A>G突变具有线粒体遗传病的特性，通过线粒体突变的产前诊断来预测新生儿患病风险有两个重要的前提，即产前样本是否具有代表性，能否体现整个胚胎的线粒体突变水平，以及mtDNA突变负荷在整个孕期是否具有稳定性。有来自小鼠和人类的研究[25-26]表明，原始生殖细胞和初级卵母细胞之间的差异大于卵母细胞和子代发育后期的差异,因此mtDNA瓶颈在早期卵母细胞行成,子宫内的mtDNA突变几乎没有组织间的差异，绒毛样本中mtDNA突变的比例代表了整个胚胎的水平。近年来一项回顾性研究[27]分析了120例胎儿mtDNA的产前诊断结果，发现无论是何种mtDNA突变，通过羊水样本(amniotic fluid sample,AFS)和CVS分析发现的突变负荷一致，证实了mtDNA致病突变在胎儿组织中均匀分布；并且产前诊断突变负荷与脐带血突变负荷无显著差异，说明在胚胎发育过程中，无论何种mtDNA突变，mtDNA突变异质性均具有稳定性。产前诊断最重要的目的是确定胎儿mtDNA突变型与野生型的比例，通常mtDNA突变载量>60%被认为有较高的风险表现出疾病症状，在此情况下父母往往选择终止妊娠；突变负荷<30%被认为出生后无或仅有轻度症状。然而突变负荷与新生儿表型间的具体关联因mtDNA突变种类不同会略有差异，且m.1555 A>G突变通常表现母系同质性遗传，无法预测子代是否会发病，只能通过避免使用导致耳聋的药物来降低耳聋发病风险，因此，此类孕妇往往不建议孕期检测突变负荷。对核基因突变引起的遗传性耳聋，可以选择产前诊断进行预防[28]。

5.2 PGD 产前诊断对预防mtDNA突变造成的遗传性耳聋起到了一定效果，但也存在局限性，比如突变百分比和疾病严重程度之间的相关性较差，且只有在确定怀孕后才能进行产前诊断。PGD也被用于预防mtDNA突变遗传，由于随机分离和遗传瓶颈效应，前期卵母细胞mtDNA拷贝数会在卵子发生过程的某个时期内大幅减少。因此，在携带mtDNA突变的患者中，可发现一些卵母细胞是无突变的。通过检测胚胎一两个细胞或受精前后的第一、第二极体，或者通过卵裂球活检，筛选临床表达阈值以下的卵母细胞或胚胎进行移植，消除了孕期夫妇是否终止妊娠的困境，为mtDNA突变携带者提供了孕育健康后代的机会。

PGD的应用首先需要确定活检细胞中定量的突变型与野生型mtDNA的比例是否能够代表整个胚胎的水平。Dean 等[29]通过对两种mtDNA基因型在小鼠雌配子和卵裂期胚胎中的分布表明，极体和成熟卵母细胞的卵浆中检测到的mtDNA基因型所占比例几乎相同，且每个分裂胚胎的卵裂球内的异质性分布模式是相同的，认为未受精卵母细胞的极体异质性水平代表了整个胚胎的异质性水平。然而也有研究对人类第一极体和胚胎突变水平分析，提出第一极体与相应卵母细胞和胚胎的突变负荷相关性较差的观点[30]；同样对滋养外胚层(trophectoderm,TE)细胞和内细胞团(inner cell mass,ICM)之间的异质性差异目前的研究也没能达成共识[31]。相比第一极体和TE，卵裂球之间的突变负荷差异更小，但是卵裂球能够发育成胎儿部分，活检是否会损伤胚胎发育潜能仍不得而知，因此，目前TE活检在临床应用最为广泛[32]。PGD用于预防异质性m.1555 A>G突变的另一个问题是由于缺乏临床数据支持,无法确定适合移植胚胎的突变阈值，且绝大多数m.1555 A>G患者携带同质性突变，PGD无法筛选到正常胚胎。

5.3 MRT MRT也称线粒体替代疗法，将线粒体突变患者健康的细胞核移植到去核的正常供体卵细胞中，获得健康的重构卵母细胞或受精卵，减少突变线粒体向下一代传递。现有的线粒体置换技术有以下3种：①原核移植(pronuclear transfer, PNT)，是指将受精卵中两个原核同时取出移入另一个去核供体受精卵内。Sato等[33]在小鼠模型首次证实PNT可用于防止突变线粒体向后代传递。 Craven等[34]利用异常受精卵进行PNT，结果近一半胚胎(4/9)检测不到供体受精卵mtDNA，剩余胚胎的mtDNA携带量平均小于2%，并且在体外培养的的后续发育是相似的。PNT的优点是原核较大，易于观察，不需要体外受精，但较大的原核在操作时也易造成更严重的细胞损伤。②纺锤体-染色体复合物移植(spindle-chromosome complex transfer, ST)，即在卵母细胞的MⅡ期将纺锤体-染色体复合物移入另一个去核MⅡ期卵中。2009年首批由ST技术诞生的恒河猴问世，且子代中来源于核源性线粒体含量均低于检测值[35]；2016年一名携带mtDNA 8993 T>G突变的母亲在ST技术的帮助下成功诞下一名婴儿，为世界首例ST技术在人类临床的成功运用，该新生儿组织中突变线粒体含量(2.36%～9.23%)远远低于其母亲，证实了该技术阻止人类线粒体突变传递的可行性[36]。目前来看PNT与ST技术各有优势，多数研究认为ST技术中mtDNA残留量更低[37]，但ST技术由于纺锤体较小，没有核膜包被，操作时不易观察，容易对纺锤体造成机械损伤；且临床实践中难以做到同步取卵，为确保核质同步而采用的冷冻技术可能会冻伤卵母细胞。③极体基因组移植(polar body transfer, PBT)，将卵母细胞的第一极体或第二极体为核供体移入另一去核卵母细胞或受精卵中。极体含有与其相应卵母细胞的相同的核物质，且含有极少线粒体,PBT中线粒体转移量远低于PNT和ST，控制好移植时间窗可提高极体的发育潜力，此外，PBT容易辨认和操作，减少了细胞松弛素、仙台病毒等药物的使用，面临的伦理争议较小，有良好的应用前景[38]。

2015年英国立法批准PNT与ST临床用于预防严重的线粒体遗传病，在安全性与有效性得到充分证实的条件下，MRT将来可能成为m.1555 A>G,突变女性携带者获得健康遗传学子代的最佳选择。

6 结语

我国每年新增3万耳聋患儿，这其中大多数是由于基因突变和错误使用药物所致，m.1555 A>G突变是氨基糖苷类药物致聋最常见的原因之一，这种不可逆的听力损失无疑会加重患者家庭和社会的疾病负担，我国人群中该突变的携带率显著高于周边国家，应重视早期预防干涉。产前诊断和PGD对于高突变负荷患者仍束手无策，MRT技术有望在同质性mtDNA突变遗传病中发挥重要作用。