PAX8与上皮性卵巢癌的关系研究

唐 帆，郭桂兰

（1.青海大学研究生院，青海 西宁 810000；2.青海大学附属医院妇科，青海 西宁 810000）

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）在所有卵巢癌中大约占90%，其致死率在妇科肿瘤中居首位。EOC 按照组织类型主要可以分为浆液性癌、子宫内膜样癌、透明细胞性癌和粘液性癌[1]，其中卵巢高级别浆液性癌（high-grade serous ovarian carcinoma，HGSC）占卵巢癌的80%，是EOC 中最致命的组织学亚型，也是恶性程度和致死率最高的妇科肿瘤[2]。目前，越来越多的组织学、分子和动物模型证据表明[3-5]，大多数EOC 病例来源于输卵管上皮（fallopian tube epithelium，FTE）。配对盒基因8 抗原（paired box gene 8，PAX8）是目前卵巢癌中公认的可用于诊断的生物标志物，是EOC 中典型的谱系存活癌基因，其在HGSC 中表达，并与输卵管上皮发育有关[6]。PAX8 通过限制基因转录在维持细胞功能上扮演重要角色，近年在基因靶向治疗方面备受关注。因此，研究PAX8 有助于了解卵巢癌的起源部位和致癌特性，并有望为治疗EOC 提供期望药物靶标。本文主要就PAX8 与上皮性卵巢癌的关系进行综述，以期为上皮性卵巢癌的临床诊断、评估病情进展及预后、指导个体化治疗提供参考。

1 PAX8的生物学特性

1.1 PAX8的结构与功能 PAX8 位于人染色体2q12-q14 上，是配对盒基因（paired boxgene，PAX）家族中的一员，该家族共有9 个基因，每个基因都编码1 个含有配对盒DNA 结合结构域，和（或）1 个八肽域，和（或）1 个同源域的转录因子蛋白。这9 个基因根据结构可以分为4组：Ⅰ组（PAX1/PAX9）、Ⅱ组（PAX2/PAX5/PAX8）、Ⅲ组（PAX3/PAX7）和Ⅳ组（PAX4/PAX6）[7]。PAX 基因家族是胚胎组织发育和细胞分化的调节因子，起着促进细胞增殖、细胞谱系特异性维持、细胞迁移和细胞存活的作用。当发育完成后，PAX 基因的表达会减弱。但是在一些组织中PAX 基因的表达仍会持续到成年，或者其重新表达也是可能的。组成Ⅱ组（PAX2/PAX5/PAX8）的3 个基因在多种类型的癌症中表达，因此有可能作为肿瘤标志物。

有学者用染色质免疫沉淀偶联测序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）技术证明PAX8 倾向于结合内含子区域（82%）超过5’-UTR调节区域（2%），这表明PAX8 可能与调控基因表达的其他启动子或非编码RNA 结合[8]。此外，PAX8 结合转录因子CTCF 和转录因子SP1，两者均参与染色质重塑。这些数据表明PAX8 既可以直接增加转录，也可以重塑染色质。另有研究表明[9]，PAX8 已显示出直接结合并增加驱动HGSC的基因（如E2F1和p53）的转录，这说明PAX8 既可以作为规范转录因子，又可以作为表观遗传调节剂。

1.2 PAX8的作用

1.2.1 PAX8 对生长发育的作用 PAX8 在胎儿器官形成中具有重要作用[10]。在甲状腺、苗勒管（苗勒管最终会发育形成输卵管、子宫、子宫颈和阴道的上三分之一）和肾脏的器官形成中起着重要的作用，而且PAX8 在成年的甲状腺和肾脏组织中仍然表达[11-14]。PAX8 是甲状腺特异性基因甲状腺球蛋白（thyroglobulin，TG）、甲状腺过氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）和钠/碘化物同向转运蛋白基因（Solute carrier family 5 member 5，SLC5A5）表达所必需的[15]。研究发现，敲除小鼠的PAX8 基因后，小鼠甲状腺较对照组小，且只有能分泌降血钙素的滤泡旁C 细胞而没有滤泡上皮细胞，因此不能产生甲状腺激素，最终出现严重的甲状腺功能减退症。进一步的分子机制研究发现，PAX8 可以直接结合到甲状腺特异性基因的启动子区域，促进它们的转录表达。PAX8 敲除的小鼠在断奶后会死亡，但如果持续补充甲状腺素，小鼠仍能继续存活6 个月，但有雌鼠会因没有正常功能的子宫和阴道开口失去生育能力，且雌鼠会出现输卵管积液和膨大[16]。研究认为，PAX8 属于主要调节因子的转录因子，能够调控包括甲状腺特异性基因之外的其他基因。PAX8 主要在女性生殖系统内的异位子宫内膜细胞、子宫腺体细胞内弥散性分布，在分泌细胞中表达，在正常输卵管与其伞端处的上皮细胞中呈现斑块状表达，在输卵管型包涵体内表达[17]。

1.2.2 PAX8 促进细胞迁移 师凯旋[18]在4 种卵巢癌细胞系中（KURAMOCHI、HEY、SKOV3 和OVTOKO）利用CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，Cas9）基因组编辑技术，用2 条独立的单链导向RNA 来敲除PAX8 基因，发现PAX8 处于调节子网络中的核心位置。同时，敲除PAX8 基因不仅抑制了细胞的增殖，而且抑制了细胞的迁移。为了排除细胞增殖和细胞运动之间的交叉影响，该研究进行了活细胞实时成像实验，发现敲除PAX8的细胞随机运动能力下降。另外，Paxillin 和F-actin的免疫荧光染色实验证实了PAX8 敲除的细胞黏着斑增加。这些研究结果表明，PAX8 在功能上可以促进卵巢癌细胞的增殖及迁移，且PAX8-FGF18 信号通路以一种自分泌的方式促进肿瘤细胞的迁移。

1.2.3 PAX8 在各类肿瘤中的表达 子宫内膜癌、甲腺癌、卵巢癌、肾气管癌等中均有PAX8 高表达[19]。在约36%的滤泡状甲状腺癌中，PAX8 会和氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）发生重排，成为1 个致癌的融合基因，仍然保留PAX8的DNA 结合结构域，调控细胞周期，促进细胞的增殖[20，21]。研究发现，随着PAX8 表达的升高，患者罹患上皮性卵巢癌以及输卵管上皮癌的概率会明显增加。另外，PAX8 在89%的内膜样卵巢癌、100%的透明细胞和96%的甲状腺癌中均存在高表达，且与患者的预后密切相关[22]。有研究结果证实[23]，PAX8 参与了妇科恶性肿瘤的发生发展，以及介导了肿瘤的恶性生物学行为，尤其是在苗勒上皮来源恶性肿瘤中高表达，对FTE 源性的恶性肿瘤尤为明显。

2 PAX8 与上皮性卵巢癌

2.1 PAX8 在上皮性卵巢癌中的机制及高表达PAX8 属于核蛋白，为苗勒氏肿瘤标记物，具有良好的特异性与敏感性，且在卵巢癌内的表达存在高特异性与敏感性[24，25]，在判断肿瘤细胞来源及鉴别细胞类型上有一定价值，可用于鉴别EOC。癌细胞系的全基因组RNA 干扰筛选是第一个确定PAX8 在卵巢癌中的重要性的方法。在卵巢癌细胞系和非卵巢癌细胞系之间的筛选中，PAX8 是排名最高的差异表达基因。敲低PAX8 可减少卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并增加细胞凋亡[26]。PAX8 可直接结合并增加p53的转录，然后增加p21 诱导增殖[27]。PAX8 还通过与RB 蛋白复合的E2f1 启动子直接结合增加细胞周期调节因子E2f1的转录，从而促进肿瘤细胞的生长[28]。研究认为[29]，PAX8 病态的改变是导致输卵管产生HGSC的基因表达变化的原因。在输卵管和浆液性肿瘤细胞之间，PAX8 共有结合基序发生改变可能会影响下游调控的基因。

与正常的卵巢组织相比，PAX8 在EOC组织中呈高表达，而在卵巢上皮内包含囊肿的无纤毛上皮细胞和3 种上皮性卵巢癌亚型细胞（浆液、子宫内膜和透明细胞）中，PAX8 表达并且定位于细胞核中；此外，PAX8 在健康输卵管粘膜的非纤毛的分泌细胞中表达，而在邻近的纤毛上皮细胞中不表达[30]。有学者通过全基因组范围内的RNA 干扰筛选来寻找不同类型癌细胞系的遗传学敏感靶基因，进而在卵巢癌细胞系中发现了PAX8 对卵巢癌的增殖和存活起着至关重要的作用，并且在16%的原位卵巢肿瘤中出现拷贝数的增加，因此认为PAX8 是上皮性卵巢癌中1 个典型的谱系存活癌基因。关于PAX8 在上皮性卵巢癌中的表达尚存在争议，有研究认为PAX8 未在上皮性卵巢癌中明显表达，而有研究则认为其不仅在卵巢癌中呈阳性表达，还可作为上皮来源和盆腔间皮来源卵巢癌的重要鉴别标志[31，32]。不同的研究的差异可能是由于各个机构的病理标本选样、手术方式、样本含量等不同所致。鉴于PAX8是FTE 谱系特异性标记物，且大多数EOC 病例来自输卵管上皮，因此可以认为PAX8 在EOC 中呈阳性表达。

2.2 PAX8 与上皮性卵巢癌预后的相关性 上皮性卵巢癌细胞的迁移与其预后密切相关。正常卵巢上皮（ovarian surface epithelium，OSE）最初被认为是卵巢癌祖细胞的位点，但是最新的证据表明正常FTE 是主要的祖细胞位点[33]。有研究使用蛋白质组学和转录组学分析PAX8 在人类卵巢癌模型以及OSE组织和FTE组织衍生的肿瘤模型中导致迁移能力增强的作用，发现PAX8 是迁移的主要调节剂，其独特的下游转录靶标取决于细胞的起源部位[34]。HGSC中的PAX8 敲低可降低细胞增殖、迁移和侵袭，同时诱导细胞死亡[35]。卵巢癌细胞中PAX8 敲低后，肿瘤进展能力减弱[36]。需要说明的是，从健康的FTE 中敲除PAX8 几乎没有功能作用，也没有显著改变基因表达[37]。因此，在卵巢癌中抑制PAX8的表达能减少癌细胞的转移，有利于卵巢癌的预后，因为卵巢肿瘤细胞依赖于PAX8，而正常FTE 不受PAX8 减少的影响。

2.3 PAX8 在上皮性卵巢癌治疗中的作用 鉴于上述PAX8的功能和作用，可以考虑利用其特性来达到治疗EOC的目的。唐海峰等[38]采用RNA 干扰技术分别处理HE4、PAX8 及HE4+PAX8 基因，结果发现，靶向沉默HE4 和PAX8 基因可增强卵巢癌细胞的化疗敏感性。因此，靶向敲降PAX8 基因可协同化疗抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力并促进其凋亡，为上皮性卵巢癌的个体化精准治疗提供了实验依据。PAX8 和Yes 相关蛋白（YAP1）亦存在联系，YAP1 是进化保守的Hippo 途径的主要下游调节因子，可调节器官大小，细胞增殖和凋亡[37]。而PAX8 主要在非启动子位点结合，并在超级增强子中富集，可以全局调节参与肿瘤发生的基因[36]。上述研究表明，PAX8 可以用于药物开发，以减少肿瘤细胞的增殖、迁移和存活，同时不影响其他器官。

另外，实验发现[39]，广谱组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂能通过重塑表观遗传标记，破坏PAX8 转录及其下游基因表达，表明PAX8 是对HDAC 抑制剂超敏的基因之一。HDAC抑制和PAX8 消耗均可引起基因表达的整体变化，包括PAX8 调节剂。该试验还组装了一个患者衍生的异种移植队列，其中包含来自七种不同类型实体癌的221 个模型，测序转录组分析表明，PAX8 在两个EOC的异种移植中表达受限。建立了2 个卵巢异种移植模型，每个模型随机分为4 个研究组，分别接受媒介物对照，顺铂，潘诺匹司他和组合疗法。经过约4 周的治疗，与单一药物相比，顺铂+潘诺匹司他组合对肿瘤进展的抑制作用更为明显，在EOC-002中实现了癌症消退，在EOC-004 中实现了稳定的疾病。免疫组织化学染色显示在潘诺匹司他存在下PAX8 表达减少，这与细胞增殖和存活不足有关。根据这些数据，研究人员建议化学疗法与HDAC 抑制剂联用可能是有价值的治疗选择，能使以PAX8 依赖性为特征的EOC 患者产生强大而持久的益处。更重要的是，有研究表明[34]，通过CRISPR 基因组改变或以胶束包裹的硫链丝菌肽进行药物治疗，靶向PAX8 可降低肿瘤负担。这些发现表明，PAX8 是卵巢肿瘤中一种统一的蛋白驱动转移，可作为治疗从FTE 和OSE 衍生的HGSC的有效药物靶标。由于PAX8 在发展中的甲状腺中起着至关重要的作用，但PAX8 缺失对成年甲状腺的影响仍然未知。幸运的是，有FDA 批准的用于甲状腺机能减退的激素替代疗法，可以减轻PAX8 目标疗法对甲状腺上皮细胞的脱靶作用。

3 总结

由于PAX8 在卵巢癌细胞的迁移、侵袭和致瘤中的发挥重要作用，卵巢癌细胞系中PAX8的丢失在体内和体外降低了肿瘤表型，并促进了细胞凋亡，因此，人们越来越有兴趣评估PAX8，不仅将其作为诊断性生物标志物，而且还将其作为EOC的潜在治疗靶标。在HGSC 中为新型癌症治疗确定药物靶标一直是一项挑战，因为它是一种异质性疾病，几乎没有共同的突变。PAX 蛋白很有前景，因为PAX8 在浆液性肿瘤中普遍表达。靶向PAX8 蛋白质可能在减少大多数患者的肿瘤生长和进展以及显着提高患者生存率方面有希望。当务之急是进一步探索PAX8 在改变卵巢癌细胞与其肿瘤微环境相互作用中的特殊功能，因为该转录因子可能具有多种机制，这对于改善当前的治疗方案可能至关重要。