储存血小板非编码RNA差异表达谱的研究及在临床输血中的应用*

郭天虹 周炜鑫 黄远帅

血小板是来源于巨核细胞并在外周血中广泛存在的细胞碎片。其众所周知的作用是促进伤口愈合和止血。但近年来，研究表明它们在介导免疫反应中也发挥了重要作用，甚至参与了包括癌症在内的各种病理生理过程[1]。虽然不同于白细胞和其他有核细胞，血小板中所含DNA很少，但它却具有极其多样的转录组，由约9 500个不同的mRNAs和不同类别的非编码RNAs（noncoding RNAs，ncRNAs）组成[2]。血小板中的ncRNAs主要包括微小RNAs（microRNAs，miRNAs）、长链非编码RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs），以及环状RNAs（circular RNAs，circRNAs），它们参与调节血小板活化、聚集、内吞、细胞骨架重排、免疫等方面，从而影响血小板相关疾病。与此同时，活化的血小板可通过释放含有细胞因子及ncRNAs的微囊泡或外泌体向其他靶细胞，如内皮细胞、单核细胞、平滑肌细胞等输出信号，从而调控这些靶细胞的功能。

储存血小板作为临床输血不可或缺的重要组成，其保存期和血液质量仍受到多种因素的影响和限制。其中血小板活化是限制血小板保存期的重要因素。近年来研究表明，血小板ncRNAs在血小板储存过程中存在着明显的表达差异，通过生物信息学挖掘，发现ncRNAs在调控血小板活化和介导血小板储存损伤中发挥着重要作用。随着miRNAs在血小板储存过程中承担的角色逐渐被认识，基于miRNAs的血小板mRNAs调控也被认为是控制血小板活化、避免储存损伤的重要机制[3]。相比miRNAs，lncRNAs和circRNAs在血小板储存和输注方面的研究还很少，同时它们在血小板储存期间的变化与血小板发挥正常功能是否有关仍值得我们进一步关注。

对血小板如何影响受血者的机体状态，研究者们也有新的看法。血小板在活化过程中释放的细胞外囊泡具有RNA含量丰富、直径小、传输稳定的特点，它们更容易穿透血管和生物屏障进入细胞外基质[4]。因此，储存血小板中若含有丰富的细胞外囊泡，则其内含物可能通过输血在受血者体内发挥特有的生理功能或调控作用。

研究ncRNAs如何参与血小板mRNAs表达的调控是了解储存血小板活化与代谢损伤等分子机制的关键，这可能有助于提高体外储存血小板的质量，延长保质期，改善输血患者的预后[5]，更好地实现精准输血。

1 储存血小板ncRNAs种类的组成和来源 血小板除了含有蛋白质外，还含有丰富的转录组。对储存血小板进行转录分析表明，血小板中含有多达9 500个不同的mRNAs，以及不同类别的ncRNAs，包括蛋白质编码位点的反义转录本，microRNAs，lncRNAs以及circRNAs[6]。

大部分血小板ncRNAs来源于巨核细胞（megakaryocyt e，MK），MK类似于神经元，可利用RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBP）与细胞核中某些新生转录本结合成复合体，从而易位到细胞质中，并通过主动运输机制将这些ncRNA复合体分选入血小板中，从而形成血小板特异性的转录本。此外，考虑到血小板与循环或组织微环境中其他细胞类型的密切相互作用，可能还存在其他细胞来源[1]。

其中microRNAs/miRNAs/MiR作为一种内源性非编码RNA，大小在19～24核苷酸，可通过识别mRNAs的3'非翻译区域的特异性结合位点发挥其调控作用[7]，进而调节蛋白质的表达[8]。据估计，60%以上的人类蛋白编码基因受miRNAs的调控[9]。血小板作为无核的细胞，由于不能从头合成mRNAs，因此mRNAs剪接和miRNAs在调节蛋白表达水平方面比在许多其他细胞类型中发挥更突出的作用。血小板在血栓形成过程中从母巨核细胞继承了包括miRNAs前体（pre-miRNAs）在内的mRNAs库，由于它们表达premiRNAs加工所需的蛋白质（Dicer，Ago2和RNA诱导沉默复合物），因此它们能够生成完全成熟的miRNAs。与此同时，在激动剂的作用下，血小板可以通过钙蛋白酶（calpain）的激活和Dicer的切割作用[10-11]干扰pre-miRNAs的成熟，以改变近四分之一的miRNAs水平[12]。大多数改变的miRNAs可通过靶向血小板激活相关的蛋白，如P2Y12受体[8]、整合素信号等参与调控细胞骨架重排、细胞运动性和免疫在内的血小板相关活动[13]，对血小板功能产生直接影响[14]。目前，微阵列和RNA测序（RNA-Seq）分析在人类血小板中鉴定了多达532种不同的miRNAs[15]。LONDIN等发现，血小板中除了有相当数量的microRNAs和mRNAs外，还含有其他种类的非编码RNA，包括长链非编码RNAs（lncRNAs）[16]。

lncRNAs是指没有编码蛋白的阅读框、长度＞200核苷酸的RNA分子。其生物发生受细胞类型和阶段特异性刺激的控制，可来源于真核生物基因组中的多个DNA元件，包括增强子、启动子和基因间区域等。涉及末端切割、小核仁RNA以及蛋白质复合帽形成等机制[17]。虽然lncRNAs不具备编码蛋白的功能，但lncRNAs在发育和基因表达中发挥的复杂精细的调控功能，参与了转录激活和抑制等调控过程。血小板中的lncRNAs含量丰富且在血小板体外活化过程中会发生动态变化，变化的lncRNAs可能参与调节血小板活化、聚集、内吞、肌动蛋白纤维聚集、肌动蛋白骨架等过程[18]。lncRNAs经典的作用机制主要包括：①在染色质层面调控基因表达；②顺式（cis）调控机制；③反式（trans）调控机制；④作为竞争性内源RNAs（competing endogenous RNAs，ceRNAs）调控分子[2]。目前关于血小板lncRNAs的研究并不多，大部分lncRNAs的功能和分子通路尚未发掘。

CircRNAs是一类具有共价闭合环状结构的ncRNA。它们是由一种被称为反向剪接的替代剪接机制产生的，在这种机制中，mRNAs前体（pre-mRNAs）下游的5'剪接位点与上游的3'剪接位点结合在一起形成稳定结构[19]。一般来说，环状RNAs可以像海绵一样隔离miRNAs，从而抑制miRNAs的功能，导致靶点基因的上调[20]。此外，它们还可以作为支架，介导特定酶和底物之间的复杂形成，并将蛋白质聚集到特定的位置[21]。但目前circRNAs在血小板中的功能尚不清楚。

可能是由于环状RNAs的稳定性和抗降解性强，人类血小板和红细胞中的circRNAs明显富集，大约是其他有核细胞的17倍以上[22]。其中PLT-circR4是血小板中含量最丰富且独有的特异性环状RNAs。在血小板激活状态下，微囊泡和外泌体可选择性地摄取和释放环状RNAs，参与供体细胞向受体细胞的信息传递[23]。

2 储存血小板ncRNAs差异表达谱 浓缩血小板（platelet concentrate，PC）作为治疗性输血的主要血液成分之一，需要特殊的存储。然而，PC即使在良好的储存条件下，也可能发生血小板的变性修饰或降解，被称为储存损伤[24]。大多数PC储存损伤变化与血小板激活有关，包括暴露于异物表面、外伤、低pH、激动剂（如凝血酶和ADP）、剪切应力、导致乳酸积累的厌氧糖酵解等[25-26]。除此之外线粒体功能障碍也可能是导致PC在储存过程中发生质变的原因[27]。

2.1 储存血小板中的miRNAs：2015年，二代测序（nextgeneration sequencing，NGS）首次对血库储存的血小板浓缩物进行完整的miRNAs测序（miRNome），发现PC中最丰富的miRNAs逐渐减少。此外，miR-127和miR-320a的表达与血小板存储时间呈负相关。这一发现为识别PC中是否存在功能正常（未激活）的血小板提供了可能[28]。2017年利用生物信息学分析，Dahiya等发现了在血小板储存过程中miR-570-3p水平升高。而线粒体ATP合酶亚基基因（ATP5L）的编码mRNA是miR-570-3p的潜在靶点，阐明了细胞通过miRNAs调控mRNAs而使线粒体功能障碍的机制。因此mir-570被提出作为一种可靠的生物标志物，用于测定储存血小板的质量和生存能力[29]。

目前认为储存血小板中miRNAs的差异表达与不同储存时间、储存条件造成的血小板激活有密切关系。此外，不同的血液处理方式，如血小板去白处理、病原菌灭活处理、辐照等也可能诱使血小板miRNAs产生表达变化[30]。已有研究证实，病原菌灭活处理易诱导血小板活化，降低血小板mRNAs和microRNAs的水平[31]。因此，miRNAs的差异表达可作为评估血小板是否储存良好的指标。

MUKAI等采用基因测序对比了不同温度储存条件下（22℃震荡保存72 h和4℃保存72 h）血小板中miRNAs的差异表达，并通过qPCR验证证实，与22℃保存的血小板样品相比，4℃保存的血小板样品mir-20a-5p、mir-10a-3p、mir-16-2-3p和mir-223-5p的表达水平显著增加。说明这些miRNAs是潜在的关键调节因子，对血小板储存条件敏感。在特定的储存条件下，这些miRNAs与血小板质量相关，并可能被用作血小板质量的生物标志物[32]。

由于血小板是由巨核细胞的细胞质碎裂形成的无核细胞，无法合成新的miRNAs，因此人们预测，在室温下保存血小板时，大多数miRNAs表达水平会随着时间的推移而下降[28，33]。但PIENIMAEKI-ROEMER等在第0天和第5天从储存的血小板浓缩物中分离PLT，发现随储存时间延长，衰老血小板残留的mRNAs种类减少，但会部分转化为miRNAs[34]。同时由于血小板微粒体（microparticles，MPs）的产生，对血小板中的miRNAs选择性打包，因此血小板中miRNAs的表达量还会进一步受到影响[35]。因此，并不是血小板的储存时间越长所有miRNAs的表达量就越低。PONTES等人也曾报道，大约有22%的miRNAs的表达水平从第1天到第5天逐渐减少，但在血液采集7天后，它们的表达量将升高，最有可能是由于血小板储存超期老化后为抑制应激蛋白质翻译所做出的响应[28]。

为了进一步明确储存血小板中miRNAs诱导血小板活化的分子机制，DAHIYA等人在2019年将研究对准了ras相关蛋白1（ras-related protein 1，RAP1），RAP1是血小板中丰富存在的一种小GTPase蛋白，参与激动剂诱导的血小板激活。研究者通过筛选靶向作用于RAP1 3'端非编码区的miRNAs（miR-320c，miR-181a，miR-3621，miR-489，miR-4791和miR-4744），并向血小板中转染miR-320c，发现在体外储存的血小板中，基于miRNAs的RAP1下调可抑制血小板的激活[36]。这也是目前发现的，可能抑制储存血小板活化的方法之一。

2.2 储存血小板中的lncRNAs和circRNAs：目前对储存血小板ncRNAs的研究主要集中在miRNA上，lncRNAs和circRNAs的研究甚少。大部分研究探讨的是疾病状态下血液循环中血小板源性lncRNA和circRNAs参与疾病进展的机制，关于它们参与血小板储存损伤和输注效果的研究寥寥无几。

2018年李楠等通过lncRNAs芯片技术检测储存2、5、8 d机采血小板中lncRNAs和mRNAs表达谱变化，发现随着储存时间的表化，lncRNAs的表达量也发生明显变化。差异表达的lncRNAs可能参与血小板激活、血小板聚集、内吞、凋亡、肌动蛋白纤维聚集、肌动蛋白骨架的调节等生理过程[37]。WEIHUA BIAN等通过高通量测序检测联合荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）验证，发现储存的血小板中含有丰富的lncRNA NEAT1（nuclear paraspeckle assembly transcript 1，GEO ID：200097348），凝血酶处理后的MEG-01（成巨核细胞细胞系）中NEAT1水平升高72%（P＜0.05），敲除NEATI基因可导致凝血酶激活的MEG-01以及血小板样颗粒黏附功能降低[38]。

严育忠等通过对单个供者浓缩血小板进行常规储存，并分别在d1、3、5、7、和9对其进行取样以分析储存期间血小板circRNAs的差异表达。采用微流体芯片电泳法评估不同保存时间血小板RNA的完整性，并通过高通量测序筛查血小板储存期间RNA降解相关的差异表达基因。结果显示：circRNAs在血小板储存期间相对线性RNA比值有增加趋势，且血小板储存期间RNA降解具有时间依赖性特征，储存后期circRNAs占比高[39]。这一研究虽揭示了储存血小板circRNAs随时间的变化规律，但并没有对circRNAs差异表达与血小板功能之间的关系做进一步分析。因此，储存血小板circRNAs是否可作为血小板存储质量的标志物尚不清楚，有待我们进一步研究。

3 储存血小板ncRNAs在临床输血领域的拓展 由于血小板在机体内发挥的功能复杂，参与的生理过程众多，目前仍无可以替代其的药物。因此，在血小板缺乏或功能异常的患者中，仍只有通过输注血小板挽救他们的生命。但迄今为止，在临床输血中，血小板仅能通过献血者获取，不可人工制备。此外由于储存期短，血小板资源极度缺乏，采用现有的保存条件（20～24℃水平振摇）延长储存时间则易造成细菌污染，而采用冷冻保存（4℃）的方式延长储存期限则会造成血小板在循环中的寿命缩短[40]。在体外不可控因素的作用下，长时间储存的血小板易发生储存损伤，这会严重影响血小板的质量，甚至导致血小板输注无效[41]。如何有效防止血小板储存损伤，挖掘储存损伤相关的发生发展机制一直是研究的重点。

目前提出的一种机制认为：基于miRNAs的血小板mRNAs调控可能参与血小板储存损伤的发生[3]。理由是，由于人类成熟的血小板是无核的，在体外储存时，血小板为了使自身存活下来，将会继续从mRNAs翻译蛋白质以发挥生理功能和调节作用。因此，利用细胞质中的转录后调节机制成为了必需，其中一种便是基于miRNAs的mRNAs调控。成熟血小板从巨核细胞中获得了许多基因调控所需成分（如mRNAs、pre-miRNAs、Dicer和Ago2）。储存条件下的血小板不仅能继续将遗传的mRNAs转化为蛋白质，还能将premiRNAs加工成成熟的miRNAs[42]。这些miRNAs在血小板体外储存时将继续发挥活性作用。缺乏或下调这些miRNAs将导致指导血小板功能蛋白翻译的mRNAs水平改变，从而影响储存血小板的功能。有研究人员发现，在血小板储存过程中，依赖于αⅡbβ3-mRNA的整合素合成增加（整合素是一种蛋白，作为纤维蛋白原受体参与血小板聚集），而参与调控整合素亚单位表达的miRNAs也被证实[43]。这说明储存血小板的功能依赖于miRNA-mRNA表达调控机制。

研究miRNAs如何参与血小板mRNAs表达的调控是了解储存血小板分子机制的关键，这可能有助于提高体外储存血小板的质量，延长保质期，改善输血患者的预后[5]。此外，有效的监测储存血小板的质量，避免一些超过储存期但仍可用血小板的浪费也是缓解血小板资源紧缺的办法之一。目前一些在血小板储存期间差异表达的miRNAs为评估血小板的可用性提供了更多的选择。如miRNA-326作为下调抗凋亡基因Bcl-xL的非编码RNA，它随血小板储存时间增加，证实了血小板在体外的凋亡受miRNAs的调控，miRNA-326的富集可能代表了血小板存活率的降低[44]，输注后血小板提升效果不佳。而miR-570由于可以与储存血小板中线粒体ATP5L的编码mRNA相互作用。因此，miR-570也可以作为储存血小板质量和生存能力的生物标志物[29]。此外miRNAs-Let-7b和miR-16两种miRNAs在血小板储存期间呈明显上升趋势，miR-7和miR-145呈下降趋势[33]，这些miRNAs对储存时间敏感，可能是评估超期储存血小板可用性的潜在标志物。

目前血小板在储存过程中引发的血小板活化和损伤几乎都是通过体外功能检测来评估的，具有局限性。与血小板功能测试不同，血小板相关miRNAs的特征伴随血小板的整个生存期，可以更准确地评估储存血小板的质量，并使评估体内血小板反应性成为可能[45]。因此，发掘血小板相关miRNAs的差异表达，对我们了解储存血小板输注对受血者产生的潜在影响有很大帮助。

虽然lncRNAs在血小板中的表达水平和功能尚不清楚，但目前已知lncRNAs是巨核细胞发育和血小板产生的重要调控因子[17]。与此同时，在巨核细胞中发现的1 109个候选lncRNAs中，几乎有一半是未注释的[46]。这也提示我们，血小板中lncRNAs的功能仍有待深入挖掘。

而circRNAs作为近年来的研究热点，细胞中的circRNAs主要在转录后水平（RNA）上对基因表达发挥调控作用，其作为ceRNAs，通过与细胞内的miRNAs结合阻断后者对靶基因的抑制[20]，同样也是储存血小板在体外存活时一种不可或缺的转录后调控方式。同时由于circRNAs可抵抗核酸外切酶和核糖核酸酶的水解作用，相比线性RNA，circRNAs不易降解退化，可在无核细胞（如红细胞和血小板）中大量富集。其富集程度可有效反应血小板转录组的退化程度，从而可用于评估储存血小板的质量和活性[19]。

4 细胞外囊泡通过传递ncRNAs参与血小板的储存与输注 血小板在活化、凋亡和破坏时会释放出细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），它包括了外泌体（由内小体形成，＜100 nm）和微囊泡（由质膜形成，100 nm～1 μm）[47]。外泌体来源于细胞内室，直径不超过100 nm。血小板源性的外泌体（Platelet-exosome，PLT-exo）占血清总外泌体的大约70%，参与了包括炎症和动脉粥样化形成在内的多种重要病理生理机制[48]。

与从细胞内室释放的外泌体相比，血小板微囊泡（platelet-derived microparticles，PMPs）本质上是从细胞质膜脱落的血小板细胞质泡状碎片，其表面表达来自其母细胞的抗原，如CD41和CD62p（P选择素）。根据其大小可与凋亡小体（＞1 μm）区分。当血小板被激动剂或炎症刺激激活时，一些microRNAs通过PMPs释放并传递到特定的细胞，在那里它们沉默靶基因，从而影响细胞功能。

由于血小板细胞外囊泡（PLT extracellular vesicles，PEVs）中RNA的含量相比其来源细胞具有更高的丰度，直径小更易穿透血管进入细胞外基质，且可穿越生物屏障，这些特点决定了PEVs发挥作用的广泛性[4]。与此同时，PEVs在传输过程中保持相对稳定[35]，可在体内转移到肿瘤细胞中并通过基因表达调控肿瘤进展[49]。最近的研究表明，血小板中含有miRNAs和miRNAs效应蛋白Argonaute 2（Ago2）复合物，可通过血小板囊泡释放到循环中，参与miRNAs到其他血管细胞的水平转移，并调节这些受体细胞的基因表达和功能[50-52]。

PIENIMAEKI-ROEMER等的研究显示，储存导致的血小板衰老会造成大部分种类的RNA降解，但同时也会伴随着参与动脉粥样硬化、炎症和神经变性的miRNAs上调，这些miRNAs在PEVs中富集并依靠PEVs作为载体在受血者体内释放，参与血管、代谢，特别是神经退行性疾病的发生[34]。一些血小板MPs和内容物（包括鞘脂、microRNAs等）具有促炎特性，输注含有这类PMPs的血小板可能会加重动脉粥样硬化和/或血小板输注相关的急性和慢性血管炎症[6]，甚至诱发严重的输血不良反应，如输血相关急性肺损伤（transfusion-related acute lung injury，TRALI）[53]。由于体外输注的PMPs在机体中的存活时间、浓度、代谢途径、相关通路等未知，因此尚不能确定他们对机体造成的影响。但这可能是我们未来的研究方向。

基于血小板外泌体和微囊泡的研究不仅为评价血小板质量提供了新的生物标志物，由于其内含物丰富、功能复杂，也可能是输血治疗的重要手段[2]。在影响癌细胞生物学的周围细胞中，血小板被认为是新的参与者，特别是血小板衍生的MVs高度参与了癌症的发展[54]。2017年J MICHAEL等发现PMPs可以渗入人类和小鼠的实体肿瘤，并在体内和体外将血小板来源的RNA（包括miRNAs）转移到肿瘤细胞中（MiR-24是转移的主要成分），导致肿瘤细胞凋亡[49]。通过输注含有MiR-24的PMPs可抑制肺癌和结肠癌异位肿瘤的生长[49]。这提示我们，基于miRNAs转运机制的PMPs输注可能是一种新的治疗肿瘤的方式。

目前虽无研究报道血小板细胞外囊泡衍生的lncRNAs和circRNAs对血管内稳态的影响，但有研究发现；血小板在体外长时间保存后，其释放的PEVs中有多个lncRNAs差异表达。通过KEGG分析对lncRNAs进行功能描述发现差异的lncRNA主要与Wnt以及Rap1、PI3K-Akt等癌症发生相关的信号通路有关，同时上调的lncRNA MSTRG.31496.1可通过顺式调控方式作用于血小板活化基因TREML1参与储存血小板的活化[2]。

而鉴于PEVs中circRNAs的稳定性和丰度，它们在血管内稳态中发挥的作用往往超过miRNAs[8，55]。有研究对不同储存时间PEVs中的miRNAs以及circRNAs的差异基因进行分析后发现，0 d vs 4 d，0 d vs 8 d，0 d vs 12 d，3个比较组中共有下调miRNAs 8个，无上调miRNAs；共有下调circRNAs 1 052个，上调circRNAs 1 071个。随后将差异的miRNAs与circRNAs结合后进行分析，构建的miRNAcircRNA-mRNA网络图显示，多个circRNAs可能与miR-4732-5p及miR-483-5p结合，从而阻断miRNAs对下游靶向癌基因的抑制。这提示储存PEVs中的circRNAs可能在癌症进展中发挥作用[2]。

多种因素，如经典的激动剂— 血小板生成素或凝血酶可导致血小板激活，释放EVs并选择性摄取血小板内的ncRNAs，它们在进入单核细胞、内皮细胞、平滑肌等细胞后参与机体靶细胞甚至肿瘤细胞的调控，这可能是输血影响机体生理病理过程的重要机制。

5 小结 随着生物信息技术的发展，由表及里的机制研究和分子互作网络逐渐成为研究的重点。通过软件预测，可挖掘出相应ncRNAs的靶点，将其作为对象进行研究。血小板作为机体的重要细胞，参与了大量疾病的发生和进展。探讨血小板及血小板囊泡/外泌体中ncRNAs的差异表达和相关信号通路对我们理清思路，发掘新的生物标志物和疾病靶标有重要意义，同时对指导我们的临床储血、精准用血有极大帮助。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突