二区近红外荧光显像技术在外科领域的应用进展

宓嘉辉 周健 杨帆

荧光显像技术是生物实时显像领域非常重要的技术手段。与传统的放射显像技术相比，荧光显像因其具有更高的安全性和分辨率而具有突出优势[1]。对于荧光显像技术而言，需要其具备对深部结构的成像能力以及更高的信背比(signal-to-background ratio,SBR)才能更好地协助外科医师在术中实时识别特定目标组织结构[2]。然而，光子在穿过人体组织的过程中会发生吸收和散射现象，对于波长较短的可见光(400～700 nm)，光子很难穿过人体组织从而导致无法实现深部组织结构的实时显像[3]。此外，人体组织本身存在自发荧光现象，当组织自发荧光与目标组织结构的荧光信号相互重合覆盖时，会导致SBR明显降低。这些因素使得采用可见光波段实现术中实时显像存在一定限制[4]。相较于可见光，近红外荧光由于其具有更长的波长，光子在人体组织中的吸收和散射有所降低。虽然已有相关研究表明，一区近红外(near-infrared-Ⅰ window,NIR-Ⅰ,700～900 nm)荧光可以更好地穿透生物组织，如皮肤和脂肪等，但NIR-Ⅰ荧光显像对深层组织的成像质量仍需进一步提高[5]。

二区近红外(near-infrared-Ⅱ window,NIR-Ⅱ,1 000～1 700 nm)荧光显像技术被认为可以进一步提升荧光显像的穿透深度以及分辨率[6]。随着铟砷化镓(InGaAs)相机的快速发展，NIR-Ⅱ荧光显像的效果有了显著的提高，为临床转化提供了帮助[7]。此外，除了传统荧光染料吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)已被证实适用于NIR-Ⅱ荧光显像，一系列新型NIR-Ⅱ荧光探针也已经被开发并利用，其中包括有机小分子，单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes,SWCNTs)，稀土纳米颗粒(rare-earth-doped nanoparticles,RENPs)，半导体量子点(quantum dots,QDs)以及共轭聚合物等各类材料[3]。该技术可以进行术中目标组织结构的实时准确识别定位，促进外科手术朝着更加精准化的方向发展。本文将围绕NIR-Ⅱ荧光显像技术在外科领域的应用进行综述，并对该技术的下一步发展前景展开讨论。

一、实体肿瘤显像

在外科领域，NIR-Ⅱ荧光应用最广泛的是实体肿瘤的术中实时显像。实现实体肿瘤NIR-Ⅱ荧光显像的荧光探针主要分为两类，一类是以ICG为代表的可以在肿瘤位置发生聚集，从而实现实体瘤实时显像的非特异性荧光染料；另一类是根据不同肿瘤特异性表达靶点，采用与之相对应的靶向受体与NIR-Ⅱ荧光染料相结合所构成的NIR-Ⅱ靶向荧光探针[8]。

ICG作为一种已被批准用于临床的非特异性靶向荧光染料，表现出了优越的实体肿瘤显像效果[9]。Hu等[10]首次将NIR-Ⅱ荧光应用于肝癌手术实时显像,结果显示，NIR-Ⅱ荧光对于肝癌主病灶的显像效果较传统显像方法有明显提升，并且利用NIR-Ⅱ荧光显像可以在术中发现术前未明确诊断的额外微小肝癌病灶。该研究还证实了NIR-Ⅱ荧光在生物组织中的穿透能力显著提升。此外，一些新型的非特异性NIR-Ⅱ荧光探针也被成功制备并被证明可以在实体肿瘤显像中取得相较于ICG更好的显像效果[11-12]。

一般认为，采用非特异性荧光染料进行实体肿瘤术中显像是通过肿瘤组织的高通透性和滞留(enhanced permeability and retention，EPR) 效应所实现[13-14]，即肿瘤区域新生的血管结构完整性较差，淋巴引流受损而导致大分子物质可以顺利地在肿瘤组织中富集[15]。然而，最新的研究提示，大分子在肿瘤区域的富集可能不仅仅是由于EPR效应所导致[16]。在临床实践中也可以观察到，采用非特异性荧光染料实现NIR-Ⅱ荧光显像，虽然可以对绝大部分实体瘤展现出良好的显像效果，但其对于某些肿瘤显像效果不佳，甚至有可能出现假阳性的显像结果[10]，而NIR-Ⅱ靶向荧光探针有可能进一步解决以上问题。

尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(urokinase plasminogen activator receptor,uPAR) 已被证实在胶质母细胞瘤中存在过表达的现象[17]。Kurbegovic等[18]利用uPAR特异性多肽(AE105)与NIR-Ⅱ荧光团相结合制作出了新型NIR-Ⅱ靶向荧光探针，实现了胶质母细胞瘤的特异性实时显像。通过这种方法，外科医师可以在术中实时观测肿瘤的位置，并且可以根据荧光显像情况明确肿瘤的边界从而保证肿瘤的完整切除。目前，已有多种针对不同肿瘤高表达物质为目标而设计的NIR-Ⅱ靶向荧光探针实现了优异的NIR-Ⅱ荧光显像效果[19-20]。

二、前哨淋巴结示踪

前哨淋巴结(sentinel lymph nodes,SLN)是指区域淋巴引流区中最先接受肿瘤淋巴引流并发生转移的淋巴结[21]。术中准确识别前哨淋巴结并对其性质进行判断可以指导下一步手术及治疗方案[22]。在临床实践中，外科医师需要借助特别的显影剂或染料实现前哨淋巴结术中显像。以往使用的以放射性元素标记的探针虽然可以有效地实现前哨淋巴结显像[23]，但放射性元素发出的辐射会对病人及医护人员造成伤害，并且不同医院对放射性物质的使用与管理模式不同，也使其应用受限。亚甲蓝等染料虽然价格便宜且不具有放射性[24]，但对前哨淋巴结检测的敏感性较低，术中也难以协助外科医师定位深部前哨淋巴结[25]。尽管采用NIR-Ⅰ荧光进行前哨淋巴结显像可以在一定程度上解决以上问题[26-27],但NIR-Ⅰ荧光由于对组织的穿透深度有限，通常需要外科医师尽可能清除表面组织才能明确地观察到前哨淋巴结[28]。

目前，研究人员尝试利用具有更强穿透能力以及更高SBR的NIR-Ⅱ荧光显像实现前哨淋巴结定位。Fan等[29]开发了一种新型有机纳米探针(IDSe-IC2F)，并通过该探针进行了NIR-Ⅱ荧光显像指导下的淋巴结显像和切除。研究人员将IDSe-IC2F注射到小肠淋巴滤泡中，并在793 nm的激光照射下，根据组织发出的NIR-Ⅱ荧光信号实现了淋巴结和淋巴管的准确定位。该方法不仅可以明确前哨淋巴结的位置，还可以判断淋巴结清除后是否存在残留。此外，不同研究人员已开发出多种不同类型的NIR-Ⅱ荧光探针，均可实现对于前哨淋巴结准确且高效的显像[19,30-32]。

三、血管的显像

临床上多使用术前影像学检查以及术中探查判断病人手术部位重要血管的位置和走向。但是，在肿瘤的压迫或粘连导致无法准确判断血管位置的情况下，医源性血管损伤风险会显著增高。此外，传统的注射造影剂后在X射线下进行血管显像的方法仍存在诸多不足：首先，该方法需要在X线照射下完成，会使得病人及医护人员长时间在辐射中暴露；其次，成像时间短、造影剂具有人体毒性等因素也导致该方法无法满足外科手术需求。最新的研究结果显示，采用近红外荧光血管显像技术可以很好地解决以上问题。

Carr等[33]通过向小鼠静脉注射ICG的方法在动物模型上实现了NIR-Ⅱ荧光血管显像。该研究发现，NIR-Ⅱ荧光可以清晰显示脑血管在皮肤以及颅骨下的位置和走向，并且相较于传统的NIR-Ⅰ荧光，NIR-Ⅱ荧光可以显著提高血管显像的SBR以及分辨率。通过制备新型的NIR-Ⅱ荧光探针，Sun等[34]进一步提升了NIR-Ⅱ荧光下血管显像效果。而Wan等[35]制备的高亮度NIR-Ⅱ荧光探针甚至可以对直径5～7 μm的血管实现清晰显像。

Mi等[36]首次在人体内使用NIR-Ⅱ荧光血管显像技术成功实现了锁骨下动静脉的实时显像，并且在该方法的帮助下完成了复杂纵隔肿瘤的完整切除。研究人员针对一例纵隔肿瘤与锁骨下动静脉关系紧密的病人，在术中经病人左侧桡静脉内注射25 mg(5 mg/ml)ICG，并采用NIR-Ⅱ荧光显像设备对肿物与锁骨下动静脉进行显像，结果显示，锁骨下静脉和锁骨下动脉分别在ICG注射后的3秒和17秒后开始清晰显像。术者在NIR-Ⅱ荧光血管显像的帮助下清晰地辨别了已经偏离了正常解剖位置的锁骨下动静脉的走行与边界，在完整切除肿瘤的同时避免了重要血管的损伤。

虽然使用ICG实现NIR-Ⅱ荧光血管显像可以达到协助手术的目的，但ICG经静脉注射后在人体的半衰期仍然较短[37]。Li等[38]开发了一种新型的NIR-Ⅱ荧光探针(LZ-1105)，其在血液循环中的半衰期可达3.2小时，从而可以持续地保持血管的良好显像。这对于需要长时间保持血管显像的手术提供了可行的方案。

四、输尿管及胆管显像

医源性输尿管损伤是盆腔手术中严重的并发症，输尿管损伤后会导致输尿管瘘或狭窄，严重者可造成感染甚至肾功能衰竭[39-40]。特别是当输尿管紧邻盆腔肿瘤或病人既往接受过盆腔手术及放射治疗后，外科医生很难准确识别输尿管的位置，导致输尿管损伤的可能性大大增加[41]。Du等[42]设计了一种聚集诱导发光(aggregation-induced emission,AIE)物质，通过向输尿管内注射该荧光物质并通过NIR-Ⅱ荧光显像，可以准确显示出输尿管的位置和走向。此外，如果出现输尿管损伤，该方法还可以准确评估损伤位置，以便及时处理。

与输尿管显像类似，在肝胆外科领域，解剖变异或炎症等因素同样会导致医生很难在术中准确识别胆管的位置[43]。有学者提出术前静脉注射ICG实现术中NIR-Ⅰ荧光胆管显像的方法[44-45]，但采用该方法肝脏的荧光背景会严重影响胆管的实时显像[46]。Wu等[47]采用NIR-Ⅱ荧光对胆管进行实时显像并与NIR-Ⅰ荧光进行对比，结果显示，NIR-Ⅱ荧光可以显著降低背景信号并具有更强的组织穿透能力。此外，NIR-Ⅱ荧光可以在小鼠胆管狭窄、穿孔以及横断模型中提供更多的组织结构信息，进一步改善了胆管以及病变位置的显像效果。

五、总结与展望

目前，NIR-Ⅱ荧光显像技术已经开始了从基础研究到临床应用的快速转化。与传统荧光显像方法相比，NIR-Ⅱ荧光显像在不同外科场景中不仅能实现更深的显像深度，而且可以更好地减少背景干扰，提升显像效果。总体来看，目前已经应用到临床的NIR-Ⅱ荧光染料仍然是传统的ICG。虽然ICG并不是NIR-Ⅱ荧光显像的最佳显影剂，但ICG通过第二发射峰同样可以在NIR-Ⅱ荧光显像中发挥很好的效果，这也极大地鼓舞了NIR-Ⅱ荧光显像领域研究人员的信心[10]。迄今为止，已有许多研究团队成功合成并制备了各类有机或无机NIR-Ⅱ荧光探针，尽管一部分新型NIR-Ⅱ荧光探针已被验证可以在成功显影的条件下保证生物安全性，但目前尚无被批准可应用于临床的新型NIR-Ⅱ荧光探针。相信随着技术的发展与人体安全性实验的不断尝试，在不久的将来一定会有新型NIR-Ⅱ荧光探针可以被广泛应用于临床。除此之外，NIR-Ⅱ荧光作为既往传统显像方法的发展和延伸，可以将该方法与传统显像方法相结合，进一步实现多模态成像，为外科医师提供更加全面且细致的生物学信息，使外科手术获益。总之，NIR-Ⅱ荧光显像作为一种新型的术中显像方法已经得到了越来越多基础学科研究人员与外科医师的关注与认可，其不断的探索必将会促进整个外科手术领域的进一步发展。