五味子藤茎多糖小鼠经口最大耐受量的测定

李 贺，陈红旭，牛胜男，陈建光

(北华大学药学院，吉林 吉林 132013)

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)为木兰科植物五味子的干燥成熟果实，习称“北五味子”，又称“玄及”“会及”“山花椒”“五梅子”等[1].《新修本草》记载其“五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有咸味”，故名五味子[2].在传统中医学理论中，可用于久嗽虚喘、自汗盗汗、津伤口渴、内热消渴和心悸失眠等病症[1]，还具滋补强身之力，有很高的药用和食用价值[3].

目前，五味子的食药部位主要为果实，其研究也集中于五味子果的炮制加工[2]、活性成分提取及药理功效[3]等.为实现果实的高产率和高品质，藤茎作为非药用部位常被减掉，除少部分作为调料粉被使用外，绝大多数则被直接丢弃[4].然而，现代药物分析研究[5]发现，五味子藤茎多糖具有和果实相似的有效成分，有研究[6]表明，藤茎多糖具有与果实多糖相似的作用，如藤茎多糖可通过抑制细胞凋亡对D-gal诱导衰老小鼠产生抗疲劳作用，抑制ACC、FAS等蛋白表达对非酒精性脂肪肝大鼠发挥治疗作用[5].因此，五味子藤茎作为五味子果实的补充资源应该深入开发[7]，在确定其药用价值的同时，对其进行毒理学安全性评价尤为重要.目前国内外尚未见有关藤茎多糖的安全性报道.

本研究通过测定小鼠MTD，可为后续进行藤茎多糖的研究提供毒理学基础.五味子藤茎若能作为五味子的补充资源进行开发，实现全株的高效利用，将有利于五味子的可持续发展及非药用部位的综合开发利用.

1 材料与仪器

1.1 动 物

ICR小鼠(长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(吉)-2020-0001)20只，体质量19～21 g，饲养温度21～24 ℃，湿度40%～60%，12 h昼夜循环，给予鼠粮5 g/只，自由饮水，适应环境7 d进行实验.本实验通过北华大学实验动物伦理委员会批准.

1.2 材 料

五味子藤茎多糖(吉林省五味子开发及产业化工程研究中心)，碳水化合物含量为28.1%；多糖提取率为6%.

1.3 仪 器

ZZ-6小鼠自主活动测试仪、YLS-13A型大小鼠抓力测定仪、BA-200小鼠避暗仪(成都泰盟科技有限公司).

2 实验方法

2.1 动物分组

按照随机平均分组的原则将ICR小鼠分为空白组(CON，蒸馏水灌胃)、藤茎多糖组(SCP，24 g/kg五味子藤茎多糖水溶液灌胃)，藤茎多糖的最大水溶量即为灌胃剂量，灌胃容积0.4 mL/10 g，灌胃2次/d，并记录体质量，连续7 d.

2.2 小鼠一般状态观察

观察实验期间小鼠中枢神经系统、呼吸系统、胃肠系统、皮肤及眼的一般状态.

2.3 小鼠行为学变化观察

实验第7天，于给药后40 min后进行避暗实验、自主活动实验、抓力实验，观察藤茎多糖对小鼠行为学的影响.

1)避暗实验：实验第6天，将小鼠放入避暗试验箱，打开明暗箱通道，自主活动5 min适应环境.实验第7天，正式进行避暗实验，记录5 min内避暗潜伏期及避暗错误次数[8].

2)自主活动实验：将小鼠置于自主活动测试仪中，观察并记录5 min内活动和站立的次数.

3)抓力实验：根据小鼠喜用爪抓物的习性进行前肢抓力测试，小鼠抓握金属杆，将前爪稳定地从金属杆拖出，小鼠可接受的最大张力即为前肢抓力.

2.4 脏器变化及脏器指数

实验第8天，应用戊巴比妥钠给小鼠麻醉后眼球取血，并取出小鼠脏器，肉眼观察脏器变化，对心、肝、脾、肺、肾、脑进行称重，计算脏器指数(mg/g)：脏器指数(mg/g)=脏器质量(mg)/动物体质量(g).

2.5 小鼠组织病理学观察

将小鼠心、肝、脾、肺、肾和脑组织浸入10%甲醛固定液中固定用于制作石蜡切片；HE染色后进行400×的图像采集.

2.6 统计学分析

3 结 果

3.1 体质量曲线

由图1可知，SCP组与CON组小鼠体质量生长曲线均呈自然稳定的上升趋势，且两组间差异无统计学意义(P>0.05).

图1 小鼠体质量曲线

3.2 小鼠存活情况

本研究结果显示：7 d内小鼠全部存活，无一例死亡，也无中毒症状发生.见表1.

表1 小鼠中毒及死亡情况Tab.1 Poisoning and death of mice (n=10)

3.3 小鼠一般状态

本研究结果显示：SCP组与CON组比较，给药7 d ICR 小鼠内未出现卧伏、对外应激反应减少的现象，大小便正常，同时也未见其他异常反应.见表2.

表2 小鼠一般状态Tab.2 General status of mice

3.4 小鼠行为学实验

3.4.1 自主活动实验

自主活动是正常动物的生理特征，可反映中枢兴奋或抑制状态.大脑皮层兴奋性与小鼠活动、站立次数成正相关关系[9].由图2可知，SCP组与CON组比较，小鼠活动次数和站立次数差异均无统计学意义(P>0.05).

图2SCP对小鼠自主活动的影响Fig.2Effect of SCP on autonomous activity in

3.4.2 避暗实验

避暗实验是利用小鼠具有趋暗避明习性设计的，分为明室和暗室，在暗室中给予电击，小鼠将被迫逃回明室[10].观察5 min内进入暗室的次数(避暗次数)及首次进入暗室的时间(避暗潜伏期)，考察小鼠的学习记忆力，判断小鼠行为状态.本研究结果显示：与CON组比较，SCP组小鼠的避暗潜伏期和避暗次数差异均无统计学意义(P>0.05).见图3.

图3SCP对小鼠避暗实验的影响Fig.3Effect of SCP on mouse avoidance

3.4.3 抓力实验

抓力测试可评价药物对小鼠肢体力量及对肌肉力量的影响，同时也可作为小鼠衰老、神经及肌肉损伤的判定标准[11].测定小鼠前肢抓力值结果显示：与CON组比较，SCP组小鼠的抓力差异均无统计学意义(P>0.05).见图4.

图4SCP对小鼠抓力的影响Fig.4Effect of SCP on mouse

3.5 脏器指数及病理学观察

本研究结果显示：SCP组与CON组小鼠的脏器指数差异均无统计学意义(P>0.05)(见表3).SCP组与CON组小鼠各组织器官颜色及形态正常，肉眼观察均无病变、出血点与坏死.各脏器组织切片HE染色结果见图5.SCP组与CON组小鼠心肌形态正常，无淋巴细胞浸润；肝脏细胞排列紧密，肝小叶结构清晰，肝细胞索清晰，间质无增生水肿；脾脏状态良好，未见出血、水肿、坏死等病理变化；肺结构正常，肺泡结构清晰，间质无增生，无水肿、充血状况，形态良好；肾脏组织肾小球结构及肾小管结构清晰，管壁清晰，未见明显增生；脑组织海马神经元结构正常，并未发现排列紊乱及坏死情况.

表4 脏器指数Tab.4 Organ index

图5组织病理学观察Fig.5Histopathological observation

4 讨 论

本研究通过五味子藤茎多糖的最大溶解量及最大灌胃量观察实验小鼠MTD.在灌胃7 d内，未见SCP组小鼠死亡，小鼠体质量曲线呈稳定上升趋势，全身状态无明显变化，中枢神经系统、呼吸及心血管系统、肠胃系统、眼及毛发等未出现异常，心、肝、脾、肺及肾等脏器指数也无明显区别.

为初步探究SCP对小鼠中枢神经系统、学习记忆能力以及运动耐力等方面的影响，我们进行了自主活动、避暗以及抓力实验.在自主活动中，与CON组相比，SCP组小鼠活动次数和站立次数差异均无统计学意义(P>0.05)；在避暗实验中，SCP组与CON组小鼠的避暗潜伏期和避暗次数差异均无统计学意义(P>0.05)；在抓力实验中，未见SCP对小鼠前肢握力产生影响.可见，SCP对小鼠的基本活动、基本学习记忆行为以及运动耐力无显著影响.除上述指标外，本研究还通过观察组织形态学及脏器重量来判断药物影响[12].脏器指数可在一定程度上反映药物对机体产生的毒性及药物产生毒性的靶器官的影响[13]，例如，肺脏指数不但可以反映机体肺部炎症情况，也可反映小鼠肺的损伤程度；脾脏指数则反映机体免疫功能；肝脏作为解毒器官，其质量变化可能与外源化合物胁迫所导致的能量支出多少有关，可将肝脏指数作为一个指标观察SCP对小鼠肝脏功能的影响.在本实验中，SCP组与CON组小鼠脏器指数差异均无统计学意义(P>0.05).脏器病理学组织切片能更直观地观察各脏器的病理变化，在一定程度上能够反映动物生长发育及损伤情况[14-15].两组小鼠病理切片显示心、肝、脾、肺、肾及脑组织均无坏死及水肿等病变，肉眼观察SCP组小鼠器官形态与CON组基本一致，说明SCP对小鼠主要脏器未见损伤.

综上所述，在SCP的小鼠经口MTD为24 g/kg，是五味子临床推荐使用量的184倍，SCP在该剂量下对小鼠的生长、生理状态及行为无影响.