黏膜菌群在结直肠癌中研究进展

梁 志，胡 江，宋晓彪，陈俊生，郝继伟，李 燕，乌日嘎，李鹏达，董振宇，牛翻燕，王继军

(1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014040；2.包头市中心医院普外三科；3.包头市中心医院检验科)

肠道是人体重要的消化器官，在消化食物、吸收营养物质的同时还产生免疫性物质从而提高人体抵抗力，对于防止外来病原体入侵起到屏障作用。人类肠道内存在大量细菌，这些细菌被称为肠道菌群。某些特定的细菌可极大地影响人类健康以及疾病的转归。2018年一项关于全国恶性肿瘤研究显示，结直肠癌发病率为第三位，死亡率为第五位[1]。肠道菌群在结肠直肠中分布密度最大，因此在结直肠癌的癌变进程中，肠道菌群的稳态对结直肠癌进展起到延缓作用[2]。结直肠癌黏膜与细菌直接接触，极易受到肠道菌群的影响，并且结直肠癌患者黏膜细胞与健康黏膜上皮细胞存在组织学差异，其肠道菌群也受到不同程度影响，伴随一定程度的菌群失衡，菌群移位以及肠道菌群相关代谢的改变。尽管肠道黏膜菌群繁多，但近年来肠道菌群鉴定方法提高，结直肠癌黏膜菌群研究也不断深入，为进一步研究结直肠癌黏膜菌群提供更多的途径。

1 肠道黏膜菌群功能

目前肠道菌群大致分为两类。第一类细菌在漫长的进化过程中与宿主细胞关系非常紧密，有非常明显的生理作用，对宿主细胞有益，这类细菌称为固有菌群或常住菌群；第二类肠道菌群与宿主细胞关系不紧密，通常不定植或短时间定植于肠道黏膜细胞表面，对肠道黏膜上皮有损害作用，这种细菌称为外籍菌或过路菌[3]。肠道菌群大部分对人体有益，可以帮助食物消化的同时参与肠道黏膜新陈代谢，以及刺激肠道黏膜细胞的免疫系统，阻挡致病性病原体进入肠道引起感染。肠道内有益菌群可阻挡致病性病原体进入机体，该过程被称为定植抗力(Colonization resistance,CR)；有益菌群还可刺激宿主的免疫反应，阻止致病性病原体的毒性因子对机体造成损害；另外，有益菌群也有助于清除肠道中的病原体及代谢物[4]。生理状态下，人体肠道内的细菌与人体关系密切，肠道内未消化的食物向细菌提供丰富的营养物质，同时肠道菌群帮助人体消化﹑吸收食物，二者互惠共生。在肠黏膜上，肠道黏膜菌群是一些特定的在肠道内具有黏附与定植能力的菌群，肠道的生物屏障则是由这些具有特殊能力的细菌组成。专性厌氧菌(Bifidobacterium)和兼性厌氧菌(Lactobacillus)是该生物屏障的主要组成部分，这两种类型细菌的减少可导致机体发生相应的病理变化。

2 结直肠癌黏膜菌群失衡

文献报道，人体中肠道菌群具有多样性﹑稳定性和修复能力。肠道菌群失衡一般是指肠道菌群的平衡受到外源性或内源性损伤因素的伤害，导致菌群平衡被打破所致，可引起相应的神经﹑内分泌和消化系统疾病的发生[5]。多数结直肠癌患者会发生不同程度的肠道菌群失衡。一些结直肠癌的癌前病变相关疾病也会伴随不同程度的菌群失衡。Mathias等[6]开展的一项研究显示，结肠炎相关的癌症中，肠杆菌科与单胞菌属增加，梭状杆菌属减少。这项研究证明结直肠癌相关癌前病变疾病的同时，肠道菌群也随之发生相应变化。同时肠道黏膜菌群失衡会伴随一些代谢物质的变化。Xia等[7]研究显示，内毒素(LPS)、D-乳酸(D-lactate)、二胺氧化酶(DAO)会随着肠黏膜菌群屏障功能的减弱而迅速增长。相关统计学分析显示，肠道内有益菌如乳酸杆菌和双歧杆菌数量减少的同时，LPS、D-lactate与DAO上升。致病菌如肠杆菌与具核梭杆菌增长的同时，也会导致内毒素、D-乳酸和二胺氧化酶增加。在结直肠癌进展中，黏膜菌群是黏膜屏障功能的主要维持者，因此肠道黏膜菌群失衡相关肠道黏膜屏障受损，主要体现在菌群多样性、炎症介质与致病性菌株变化这三个方面。

2.1黏膜菌群多样性降低 有研究表明，菌群多样性失衡在结直肠癌患者中有一定程度的发生。通常采用平板活菌计数法，以活菌形式的双歧杆菌与大肠杆菌二者数量的比值(B/E)计算。该值常以10为临界线，即健康成人的双歧杆菌数目是大肠杆菌数目的10倍，若数值小于正常值通常判断为肠道菌群失衡。目前在结直肠癌术后该值倒置现象比较明显[8]。结直肠癌患者黏膜菌群同样发生与粪便菌群相类似的菌群失衡。Ulrich等[9]研究表明，结直肠癌患者的黏膜菌群较健康成人黏膜菌群的多样性有降低。Kristin等[10]在一项动物实验中显示，患结肠或直肠癌的狗，其粪便与黏膜的菌群在丰度上有明显改变。尽管患有结直肠癌的犬类数量极少，但现有实验结果表明，以狗为代表的犬科类动物，粪便菌群与肠黏膜菌群的差异具有统计学意义。Chen等[11]研究显示，一些结肠癌或直肠癌患者其粪便菌群与黏膜菌群在菌群多样性以及菌群含量方面都有区别，肠道黏膜菌群的类别更为庞大，主要表现为厚壁菌群(Phylum Firmicutes)在黏膜菌群中极其丰富，但是变性菌与拟杆菌数量则相对较少。从整体菌群结构层面分析，发现结肠癌或直肠癌患者与健康人群菌群结构基本相似。然而从菌群的多样性层面分析，发现结直肠癌患者菌群多样性较健康人群偏低，乳酸杆菌含量丰富，粪杆菌属(Bacillus faecalis)含量高，同时该实验发现结直肠癌组织与癌旁组织的肠道菌群类似。Burkhardt等[12]通过对54例接受结直肠癌手术患者的黏膜菌群分析，发现癌组织与癌旁组织的微生物总体组成非常相似。Gao等[13]开展了一项关于在结肠与直肠不同解剖部位层面上是否癌组织与癌旁组织菌群存在多样性差异的调查，结果显示癌组织与癌旁组织在菌群多样性方面没有差异。上述癌旁组织菌群多样性与癌组织菌群多样性并无差异，可能由于在实验过程中二者位置相对临近，菌群间差异不明显，也可以初步假设癌旁组织的菌群不同程度上受到癌组织菌群的影响。黏膜菌群通过与肠黏膜上皮细胞直接作用促使结直肠癌发生。

2.2炎性因子的变化 许多肿瘤都伴有一定的慢性炎症，尤其在结直肠癌的发展过程中极为显著。有研究表明在原发性结直肠癌中，伴有炎性细胞与炎性因子的上升[14]。近期有研究显示，在结直肠癌的进展过程中，F.nucleatum可激活E-cadherin信号通路，从而激活T细胞产生炎性因子，如β-catenin、NF-κB、c-myc和cyclin D1等，这些物质会导致结直肠癌细胞过度增殖[15]。同时一些研究者发现，若结直肠癌组织受到牛链球菌感染，则会高表达某些促炎介质，如IL-1β、白介素8与环氧化酶2，这些炎症因子会随着结直肠癌的发生具有不同程度的改变[16]。Iradj等[17]研究发现，与健康人群相比较，结直肠癌患者发生菌群失衡的同时，患者肠黏膜会高表达白细胞介素17(Interleukin-17，IL-17)，这是第一次发现结直肠癌患者肠道菌群的改变可引起黏膜免疫反应，导致相应的炎性因子发生改变。目前研究结直肠癌患者菌群引起相应的炎性因子变化，以采集患者粪便的形式为主，鲜有研究患者黏膜表面的菌群。黏膜菌群直接接触黏膜上皮，黏膜上皮细胞的免疫反应是否受到黏膜菌群的影响，是今后研究的焦点。

2.3致病性菌株的增加 结直肠癌发生的病因尚不清晰，但消化道疾病中，致病性菌株在癌症的发展进程中起一定的促进作用。因此在结直肠癌患者菌群失衡方面的研究，更加关注于致病性菌株。Kostic[18]团队利用最新的全基因组序列检查技术，探究结直肠癌组织与其临近的癌旁组织是否存在某些丰度上有明显差异的细菌种类。结果显示，一些结肠癌与直肠癌患者梭状杆菌的含量在宏基因组序列中升高。为了验证结果，其采用qPCR(quantitative real-time PCR)方法对95组直肠癌与结肠癌患者进行具核梭状杆菌的含量测定，结果表明与健康人群的肠道组织相比较，结直肠癌患者的具核梭状杆菌含量明显升高。为进一步验证其结果的可靠性，Kostic等[19]又进行了动物实验，发现具核梭状杆菌饲养组的小鼠与正常进食的小鼠相比较，观察组小鼠恶变的进程明显加快。目前具核梭状杆菌的致病机制尚不明确，大多数学者认为该菌的黏附与定植、传播侵入宿主的结直肠黏膜上皮细胞是细菌发挥毒力作用的重要环节。

脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)在人体内比较常见的厌氧菌，生理状态下，可以维持消化系统的平衡能力。有研究报道，脆弱类杆菌中有一种产肠毒素的脆弱类杆菌(Enterotoxigenic bacteroides fragilis，ETBF)，其分泌的脆弱类杆菌毒素(Bacteroides fragilis toxin，BFT)可导致成人腹泻。一些研究表明，在结直肠癌黏膜上，BF一定程度可以诱导结直肠上皮细胞系Caco-2的IL-8与HT29表达以及激活NF-KB[20]。BF还可以与结直肠上皮细胞的HT29/CT相结合，导致肿瘤抑制蛋白E-cadherin分解，同时黏附分子β-catenin核移位，T细胞因子靶基因表达增加，导致细胞持续增殖[21]。除此之外，产肠毒素脆弱类杆菌以分泌脱氧胆酸的形式间接促进结直肠癌发生。在动物实验发现，脱氧胆酸可诱导结直癌黏膜体外增殖[22]。目前，对于产肠毒素脆弱类杆菌的研究仅限于基础的体外细胞与动物实验以及小样本的人体研究，其发病机制仍需要大样本的人体数据。在研究结直肠癌患者切口愈合的一项实验中，结直肠癌患者黏膜组织除正常黏膜菌群外，还存在一些侵入性细菌如沙氏别样杆菌(Alistipes shahill)、害肺小杆菌(Dialister pneumosintes)等,这些细菌影响患者的切口愈合时间[23]。

3 结直肠癌黏膜菌群代谢

由于肠道菌群代谢组学的进步，伴随高通量测序技术进一步发展，人们越来越关注肠道菌群与其代谢物的研究。肠道黏膜菌群的致癌机制尚不明确，但是在结直肠黏膜癌变进展过程中，肠道黏膜菌群的代谢产物影响结直肠癌的发生。Petra[24]研究发现，未消化完全的食物抵达肠道后，许多人体非内在物质会在肠道菌群作用下生成，例如食物在与结直肠癌黏膜相接触的同时，受到肠道菌群的作用，生成一些特定物质，如SCFAs(Three short-chain fatty acids),该物质是肠道中一些富含膳食纤维难以被消化的化合物，经肠腔内的黏膜菌群作用下发酵产生。SCFAs的一些分解产物在肠道菌群作用下，产生相应的代谢物对肠道黏膜形成一定的保护作用。一项关于结直肠癌患者黏膜菌群相关性分析研究表明，结直肠癌患者菌群失衡常表现为SCFAs耗竭，主要因为乙酸、丙酸与丁酸的短链不饱和脂肪酸被结肠上皮吸收[25]。有研究显示，在肠道菌群作用下，SCFAs的分解产物丁酸盐在动物实验中，可导致结直肠癌上皮凋亡，有效缓解肠道上皮细胞DNA的氧化损伤，对结直肠癌细胞起到抑制作用。还有研究者发现，结合型的初级胆汁酸流入肠道后经过一系列的反应转变为次级胆汁酸，此过程通常受到肠道黏膜菌群的作用，产生活性氧自由基。传统观点认为癌症是正常细胞异常增生所致，细胞增生的过程伴随染色体的复制，由于肠道中胆汁酸的转变过程中，伴随产物活性氧自由基产生，导致染色体紊乱，促使结直肠癌发生[26]。一些研究者认为，富含高蛋白的食物残渣经过硫酸盐还原菌的作用，可以转变为H2S,该物质具有遗传毒性的作用，可导致肠道上皮细胞发生恶性的转化形成癌变[27]。

4 结直肠癌黏膜菌群研究方法

随着科技的进步，肠道黏膜菌群的研究方法由传统直接涂片法与平板活菌计数法，转变为以分子生物学技术为基础的高通量测序和以宏基因组学为代表的新型研究技术。

4.1传统研究方法

4.1.1细菌涂片法 细菌涂片法是较为简单的一种方法，一般先将细菌用相应的染料染色，然后放置在于显微镜下观察。此方法操作简便，但是缺点也比较明显，仅能鉴定其中约1 %的极少数的细菌，不能反映人体肠道内真正的菌群情况。

4.1.2平板活菌计数法 该方法需要结合一些选择性培养基培养细菌。在分离细菌的同时，依据各种血清学、染色等一系列方法对细菌鉴定，后倍比稀释，再进行菌落计数。该方法以研究细菌微生态三定原则(定位，定性，定量)的角度分析，优于涂片法，在原籍菌和过路菌的定量变化方面比较明显。但是该方法最大的缺点在于需要耗费大量的时间去培养细菌，对于广大一线临床医生而言，相对耗时、耗力。

4.2现代研究方法

4.2.1高通量测序 目前研究肠道黏膜菌群最广泛的研究方法是高通量测序的方法。Nelson等[28]在文章中讲述该方法针对特定长度的PCR产物进行测序，主要测定16SrRNA,因为大多数细菌包含16SrRNA，并且以操纵子的形式存在。目前临床研究者广泛采用第二代高通量测序技术，可以获取无法分离培养的菌株，对肠道菌群进行多样性的研究，但是此方法容易受到样品处理的影响以及分析方法不够全面的限制，在反应样品中的菌群结构方面较差[29]。

4.2.2宏基因组的衍生 由于测序技术的快速进步，费用大幅降低，研究员越来越倾向于采用宏基因组的方法研究结直肠癌黏膜菌群的功能与分类，该方法可以测定任何菌群的所有基因[30]。但是该技术无法区分死亡的细菌与活菌[31]。

4.2.3其他方法 除上述菌群检查方法外，在肠道黏膜菌群研究领域也经常涉及凝胶电泳技术，其中变性梯度与温度梯度凝胶电泳两种技术在肠道黏膜菌群的检查中最为常用。方法基于DNA指纹图谱方法，利用DNA片段在特定温度下溶解的性质使其分离的一种凝胶系统，将DNA序列中排布有差异的DNA分离，在聚丙烯酰胺凝胶的不同位置留下不同分子标记的菌群，电泳图谱上的印记则显示肠道菌群的组成结构。16SrRNA-PCR联合DGGE是目前较为常用的肠道菌群状况的一种检测方法。

5 益生菌群在结直肠癌黏膜上皮的作用

大量研究显示，在肠道黏膜上，某些益生菌(Probiotics)可以改善肠道功能，促进人体健康，例如双歧杆菌，乳酸杆菌等。Enck等[32]研究显示，由于年龄增长，某些肠道菌群的数量随之增加，例如大肠杆菌等，而某些菌群则随年龄增长而减少，例如拟杆菌属等。但是双歧杆菌与乳酸杆菌却依然保持稳定，可能因为人体机能随年龄衰退时，益生菌对保持人体健康起关键作用。有研究表明，在结直肠癌发生﹑发展中，益生菌发挥一些抑制效应。针对性研究益生菌在结直肠癌中作用的流行病学调查仍较少。一项动物实验研究表明，在动物的进食过程中外源地补充益生菌能影响肠道的菌群，可以使肠杆菌减少，乳杆菌增多，同时对结直肠癌的发生起到抑制作用[33]。Ashley等[34]探索一项外源性进食有益菌对结直肠癌患者黏膜上皮菌群影响的研究中发现，接受有益菌干预的结直肠癌患者肠道内产丁酸盐细菌含量升高。丁酸盐是短链不饱和脂肪酸的一种类型，对结直肠癌上皮细胞癌变起到一定的抑制作用。同时最新的一项基于使用益生菌制剂对早期结直肠癌根治术的作用研究显示，使用益生菌制剂可提高患者免疫系统的活力，一些免疫细胞如自然杀伤细胞、CD4+与CD8+细胞的数量提高，并且一些肠道黏膜屏障功能评价指标如二胺氧化酶、血浆D-乳酸、内毒素与肠道脂肪酸结合蛋白的水平也有一定程度的下降，显示肠道益生菌制剂对肠道黏膜稳定性的维持有促进作用。该实验采用最新的16sDNA高通量测序技术，发现在属水平上，使用益生菌制剂的患者有益菌相对丰度较之前有提高，同时某些条件致病菌如粪肠球菌及葡萄球菌属降低[35]。

但是目前益生菌抑制结直肠癌发生的机制尚不明确，有几种学说被广为接受。第一种假说认为，益生菌群可以抑制肠上皮异形隐窝的形成，而异性隐窝则是结直肠癌形成的早期形式，其与结直肠高分化腺瘤的发生有密切联系。在一些动物实验中，显示嗜酸性乳杆菌可以减少异性隐窝的数量[36]。第二种假说认为，结直肠黏膜上的有益菌群可增强肠黏膜屏障功能，结直肠黏膜屏障受损则是结直肠癌发展阶段的重要变化。肠道黏膜的益生菌群有稳定肠黏膜屏障的功能，其中在肠黏膜表面的黏液层有重要作用，该黏液层对肠黏膜有保护作用。Sana等[37]研究显示肠道黏膜菌群与肠道黏液间的相互作用共同维持人类健康。一方面，对于肠道黏膜菌群而言，肠道黏液层可作为细菌的主要碳水化合物来源，另一方面，肠道菌群也会一定程度上影响肠道的黏液层。肠道黏液层的构成主要为黏液素，而黏膜菌群凭借分解或者合成黏液素来改变黏液层的结构，因此肠道黏膜菌群的失衡会影响肠道黏液素的结构，从而进一步减弱黏液层结构的稳定，加剧肠道黏膜屏障的损伤。在一些动物实验中，肠道的黏膜菌群失衡加剧肠道黏液层的结构紊乱，导致结直肠癌发生。黏液层中主要成分是黏液素2(Mucin2，MUC2)。研究表明，小鼠MUC2缺陷导致结直肠癌发生[38]。综上所述，肠道黏膜益生菌对结直肠黏膜上皮有一定的保护作用，其机制在未来会有更深入研究。

6 研究展望

黏膜菌群失衡导致结直肠癌发生的机制尚不明确，黏膜菌群与结直肠癌的关联仍有大量未知领域有待研究。随着人类对肠道菌群分离技术的提高，肠道黏膜菌群分析将会不断深入。目前，肠黏膜菌群的研究仅限于初步对已知菌株的分离及含量的鉴定。肠黏膜菌群相比以粪便为代表的肠道菌群，在反应肠道菌群方面更加真实，但该方法属于有创性检查，样本收集难度大，菌群代谢产物在结直肠癌上皮癌变过程中的作用仅停留在动物实验过程中。下一步希望研究关注人体的临床结果，通过对疑似结直肠癌患者，常规行电子肠镜检查获取样本，克服样本量较少的问题，从而进一步获取精确结果。同时其研究结果将有利于指导结直肠癌的预防、诊疗与预后评估。