猪轮状病毒诊断方法研究进展

袁 生，王聪颖，郭锦玥，黄淑坚，温 峰

(佛山科学技术学院 生命科学与工程学院，广东 佛山 528225)

猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)是导致仔猪流行性腹泻的主要病原之一，可以引起仔猪腹泻、厌食和呕吐等症状，严重威胁着养猪业的健康和发展。随着检测技术的快速发展，PoRV的检测技术不断更新换代，主要有病原学、免疫学和分子生物学等鉴别诊断方法，为PoRV的防控提供了有效的应对措施。

PoRV常与一些肠道病毒混合感染使病情加速恶化，造成难以挽回的严重损失。更经济高效且灵敏的PoRV鉴别诊断技术对保障养猪业健康发展具有重要的意义。近年来，随着分子生物学诊断方法的迅速发展，诸如常规反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)、荧光定量反转录PCR(reverse transcription fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)、荧光环介导逆转录等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)、二代测序、RNA原位杂交检测(ISH-RNA)和Luminex xTAG等分子诊断技术的应用推动了PoRV诊断方法的快速发展。本文综述了PoRV诊断方法的研究进展，为PoRV的诊断提供新思路。

1 病原学特征

1.1 病原组成

PoRV是呼肠孤病毒科轮状病毒属的成员[1]。PoRV无囊膜包被，形状类似车轮，在电镜下观察病毒粒子直径大小约为70 nm，其基因组由11个独立片段的双股正链RNA组成，共编码6种结构蛋白(VP1～VP4、VP6和VP7)和6种非结构蛋白(NSP1～NSP6)，其中第11节段编码NSP5和NSP6两种非结构蛋白[2]。该病毒粒子从内到外可分为核衣壳、内衣壳和外衣壳。核衣壳由VP1、VP2和VP3组成。VP6蛋白是构成轮状病毒内衣壳蛋白的主要成分。VP4和VP7蛋白共同构成轮状病毒的外层衣壳结构蛋白[3]。

1.2 蛋白功能

结构蛋白VP1具有核糖核酸聚合酶的特性，与PoRV的复制密切相关[4]。此外，结构蛋白VP2和非结构蛋白NSP5对PoRV的复制具有重要意义[5]。在先天性免疫应答中，结构蛋白VP3可以阻止细胞寡聚腺苷酸合酶途径的激活，非结构蛋白NSP1在干扰宿主的自然免疫应答中扮演着重要角色，因此NSP1和VP3对先天免疫拮抗的结构和机理基础提供了重要见解[6]。衣壳的外层由VP7和VP4组成，可诱导病毒中和抗体，并且对PoRV的外形及外壳蛋白的稳定和病毒的成熟非常重要。VP4由胰蛋白酶切割产生VP8(28 kDa)和VP5(60 kDa)片段，它们能促进PoRV与宿主细胞结合的能力[7]。结构蛋白VP6是介导粘膜免疫的特异性抗原，具有很强的免疫原性[8]。与此同时，非结构蛋白在PoRV生命链中也发挥着重要作用。其中，非结构蛋白NSP2参与PoRV的形成，以及基因组复制和病毒组装[9]。在重组病毒过程中产生的NSP3能诱导细胞poly(A)结合蛋白的核聚集[10]。尽管PoRV是无囊膜病毒，但病毒附着到细胞膜后，会采用已经裂解的VP4蛋白的融合机制，通过质膜穿孔进入细胞，这是除了受体介导途径之外的另一种病毒进入途径[3]。NSP6是由基因11的异相开放阅读框(open reading frames, ORFs)编码的核酸结合蛋白，虽然其ORFs存在于大多数PoRV中，但NSP6非病毒复制所必需[2]。

2 流行现状

2.1 临床症状

猪轮状病毒病是由PoRV引起的猪急性肠道传染病[11]。其基本特征为呕吐、腹泻和脱水。在临床中，仔猪在感染该病后初期采食量减少、精神不振、行为懒散和伴发呕吐症状，并且其腹泻最为严重，粪便呈水样或糊状，颜色为黄色或黑红色[12]。成年猪表现精神不济、食欲减退和腹泻，母猪则可出现流产和死胎症状。

2.2 病理剖检

剖检后发现患病猪的病理性变化主要集中于消化道，特别是小肠。其胃内充满没有消化的乳凝块和乳汁，且胃壁松弛[13]。肠道内有黑色或黄色水样内容物，肠壁变薄变透明，肠系膜的淋巴结异常肿大，肠绒毛缩短，可以看见发生增生的隐窝细胞和浸润的淋巴细胞[14]。

2.3 流行历史

猪A型轮状病毒、猪B型轮状病毒和猪C型轮状病毒与仔猪的腹泻密切相关。近年来，在日本、巴西和美国的猪腹泻样本中分离到了猪H型轮状病毒，且证实这一新型轮状病毒也是造成仔猪腹泻的病原之一[15]。PoRV引起的仔猪腹泻一般发生于早春、深秋和寒冬，且各个年龄阶段的猪均表现易感。其中，2～6周龄仔猪发病多，死亡率在50%以下[16]。自2010年底以来，中国多地大规模爆发了由PoRV引起的仔猪严重腹泻。Xue等[17]从山东10个出现腹泻的农场采集到1～3月龄的乳猪和断奶猪共226份样本，其中有65份(28.76%)检测到PoRV。随后，Zhang等[18]在华南5个省份的168个养猪场收集了总共2 987个样本进行检测，结果显示PoRV常与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪Delta冠状病毒(porcine delta coronavirus, PDCoV)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)等肠道病毒混合感染。

3 检测技术

3.1 病原学检测方法

3.1.1 细胞培养分离病毒 根据病毒的细胞噬性，选择相应的原代细胞或传代细胞系进行病毒分离及培养。Bohl等[19]在试验中发现，将临床PoRV阳性样品经胰蛋白酶处理后，接种于恒河猴胎肾细胞(MA104)，成功地分离出轮状病毒(rotavirus, RV)，解决了细胞分离培养RV的问题。随后，马士博等[20]对PoRV HeBei-12株的生长特性进行研究，绘制了生长曲线并确定了病毒在MA-104细胞上的最佳繁殖时间。虽然已经成功分离培养出PoRV，但是细胞分离培养病毒周期较长，并且操作难度大、成本高，不利于对临床样品进行大规模检测。

3.1.2 电镜观察 基本原理是利用电镜直接观测样本中是否存在病毒颗粒。其中，实验室常用直接电镜检测法和免疫电镜检测法。王振玲等[21]用直接电镜检测法观察到病毒颗粒形态结构，并鉴定出PoRV。当PoRV与PEDV和TGEV等其他病毒混和感染时，可以使用免疫电镜检测法，通过特异性抗体捕捉病毒，观察聚集的病毒抗原复合物来进行鉴定，还可以采取多价抗体，满足同时检测其他与腹泻相关病毒的要求[22]。Benfield等[23]比较了病毒细胞分离培养、免疫电镜检测法和荧光抗体技术检测PoRV的敏感性，发现免疫电镜检测法敏感性强于荧光抗体技术和病毒细胞分离培养。

3.2 免疫学检测方法

3.2.1 乳胶凝集 乳胶凝集试验是采用乳胶粒子作为载体的间接凝集试验。该方法操作简单、成本低且检测快，但需要具备充足的经验来判断结果。Sanekata等[24]改进了一种能快速确诊PoRV的简便凝集试验方法。Sobanski等[25]使用超声悬浮处理病毒颗粒后进行乳胶凝集试验，发现检测PoRV抗原的灵敏度比改进前提高了32倍。这些改进举措大大推动了乳胶凝集检测方法的应用。

3.2.2 免疫胶体金 主要是利用胶体金免疫显示技术，包被诊断标记物对靶定的抗原或抗体进行检测。崔晓辰等[26]利用猪A型轮状病毒OSU毒株(G5型)VP6蛋白的特异性单克隆抗体制作猪A型轮状病毒胶体金免疫层析试纸条，可以检出5.4 μg/mL纯化的PoRV OSU毒株抗原和1.0×103.4TCID50/mL病毒。这种方法与其他免疫学检测方法相比，检测效率高、特异性强、敏感性好，且可视化检测结果。

3.2.3 ELISA 利用生物素-亲和素系统，对检测物靶定的辣根过氧化物酶标记的抗原或抗体进行显色，并通过显色程度对检测物进行定性甚至是定量。Memon等[27]通过使用VP6靶向的兔多克隆抗体，开发了一种快速、高度特异性和灵敏的抗原捕获酶联免疫吸附测定(AC-ELISA)方法，且AC-ELISA的检出限与常规逆转录聚合酶链反应基本一致。王婧怡等[28]利用ELISA检测方法对感染PEDV、PoRV和TGEV的发病种猪血清样品进行了血清学检测，证实PoRV感染率最高。

3.3 分子生物学检测方法

3.3.1 RT-PCR 在RT-PCR中，将病毒RNA逆转录为cDNA，针对病毒基因组的保守区域设计引物，通过聚合酶链式反应扩增目的基因。赵凤菊等[29]建立猪A型轮状病毒NSP4基因RT-PCR检测方法，该方法最低检测浓度为13.17 pg/μL，应用该方法对临床样品进行了检测，样品阳性率为90%，与GenBank中其他猪A型轮状病毒NSP4基因序列同源性均在98%以上。在此RT-PCR基础上，逐渐延伸出多重RT-PCR诊断技术，可同时检测多种猪源病毒。Ding等[30]建立PEDVN基因、TGEVN基因、猪A型轮状病毒VP7基因、猪库布病毒(Porcine Kobuvirus, PKoV)多聚蛋白基因、猪札幌病毒(porcine sapporo virus, PoSaV)多聚蛋白基因和PDCoVN基因的多重RT-PCR检测方法，该方法的检测限为100～101 ng cDNA。结果表明多重RT-PCR适用于PoRV，这种方法灵敏度好且效率高，可应用于多种病原感染的临床鉴别诊断。

3.3.2 RT-qPCR RT-qPCR可根据试验目的选择嵌入染色剂，是对特异性核酸序列进行检测的高敏感度技术。许梦怡等[31]根据TGEVM基因、PEDVM基因和PoRVVP2基因序列，成功建立了这3种病毒的TaqMan探针多重RT-qPCR方法。该方法对PoRV检测灵敏度为4.96拷贝/μL，PoRV组内重复试验的C.V.最大值和组间重复性试验的C.V.最大值均不超过5%，表明该方法重复性好。用此方法对这3种病毒样本进行检测,均没有交叉反应,表明此方法特异性好，但是探针等材料价格昂贵，所以试验成本较高。随后，李军等[32]对TGEVS基因、PEDVS基因和PoRVNSP基因建立了多重RT-qPCR方法，PoRV的最低检测量为25拷贝/μL，组内和组间变异系数小于5%，该方法与商品化的试剂盒检测结果符合率达100%。RT-qPCR与RT-PCR相比，灵敏度高、特异性强且效率高。Jia等[33]基于双引物寡核苷酸(DPO)的RT-qPCR方法，针对TGEVN基因、PEDVN基因、PDCoVN基因和PoRVVP7基因，在临床样本中准确鉴别PEDV、TGEV、PoRV和PDCoV。结果表明，与传统引物相比，DPO引物拥有更宽的退火温度范围，且具有更高的引物特异性，但是DPO引物的3'-或5'-端有超过3个核苷酸与DNA模板不匹配，导致PCR扩增效率将大幅降低。该方法对PEDV、TGEV、PoRV和PDCoV临床标本的检测限分别为8.63×102拷贝/μL、1.92×102拷贝/μL、1.74×102拷贝/μL和1.76×102拷贝/μL。与传统的RT-PCR方法相比，该方法的检测精度更高，为PoRV的鉴别诊断提供一种有效的手段。除此之外，Liu等[34]成功建立出PEDV、TGEV、猪A型轮状病毒、猪C型轮状病毒和猪圆环病毒2(porcine circovirus 2，PCV2)多重RT-qPCR。在这项研究中通过扩增序列大小不同，检测和区分不同的病毒，实现了PoRV的快速高效率的鉴别诊断。随后，曲雅新等[35]成功建立PoRVVP6基因、PoSaVRdRp基因和猪星状病毒(porcine astrovirus，PAstV)ORF1基因的三重PCR检测方法。Wen等[36]建立了基于EvaGreen荧光染料和熔解曲线分析的多重RT-qPCR方法，在一个封闭的单管中同时检测TGEV、猪A型轮状病毒、猪C型轮状病毒、PEDV和PCV2，根据5种病毒对应5个不同的Tm值，在多种病原中成功鉴别诊断出PoRV。该方法对这5种病毒的检测灵敏度较高，检出限为5～50 拷贝/μL，且重复性好，Tm和循环阈值的变异系数分别小于0.32%和2.86%，对90份现场样品进行单、多重RT-qPCR检测，符合率为91.1%。所以EvaGreen多重RT-qPCR是一种快速，灵敏且低成本的诊断工具，可以适用于PoRV的常规检测。

3.3.3 RT-LAMP RT-LAMP是在等温条件下完成体外核酸扩增反应的一种新型分子检测技术，唯一需要的设备是恒温加热块或水浴。此外，当在荧光染料存在时，可以用肉眼直接观察反应结果，且染料还可以使用荧光检测器来跟踪反应过程。胡兴义等[37]依据GenBank的PoRVVP7基因保守区序列，设计了6条特异性引物，通过对外引物与内引物浓度比、Bst DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度和反应条件等进行优化，成功建立和应用PoRV RT-LAMP检测方法。随着RT-LAMP技术的成熟发展和广泛应用，Wang等[38]通过RT-LAMP成功区分PoRVN基因和其他导致仔猪腹泻的病毒。该方法检测迅速、灵敏度比传统PCR高100倍，对PoRV的临床诊断提供了一种新型的方法。

3.3.4 二代测序技术 该方法通过直接对种间和种内水平的病毒株进行测序，可以深入地描述快速变异病毒群体之间的遗传多样性，并且在一代测序技术的基础上进行了变革。Vidal等[39]通过二代测序技术调查了在猪场中爆发的16例猪腹泻相关病例，其中检测出猪A型轮状病毒，且其VP7和VP4基因发生了突变。紧随其后，Cortey等[40]通过二代测序技术检测了47个农场中腹泻新生仔猪粪便，探讨了西班牙腹泻新生仔猪粪便中RNA病毒的多样性，只使用提取的总RNA，而不需要任何扩增步骤，其中所获得的结果代表样本中大多数存在的RNA病毒，并且发现了猪B型轮状病毒和猪C型轮状病毒几种新的VP7和VP4基因。虽然该方法成本高昂，但是它利用了高通量测序平台，对物种的基因组进行分析，能更快更好的监测新物种的出现及其流行,并且该技术已成功应用于猪粪便病毒基因组的多样性鉴定。

3.3.5 ISH-RNA ISH-RNA是一种用于检测福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织切片中特定核酸序列的方法。与PCR相似，ISH基于RNA序列，但具有识别组织损伤中核酸的能力。传统ISH技术特异性好，但是短核苷酸序列的标记效率较低且敏感性有限。Resende等[41]开发了一种新颖的ISH-RNA，用来检测PoRVVP6基因，通过同时检测1个或2个探针，研发出一种用于检测猪A型轮状病毒、猪B型轮状病毒和猪C型轮状病毒的双链分析的ISH-RNA技术。虽然该方法仅能检测103个PoRVRNA拷贝/mL，但是通过特异性杂交信号的放大克服了经典ISH技术的局限性。新的ISH-RNA检测可用于PoRV的常规调查，以防控PoRV广泛流行，但仍处于初步探索阶段。

3.3.6 Luminex xTAG 该方法采用Luminex 特有的通用标签，通过标签序列与反标签序列的专一性互补配对，进行核酸试验优化。Shi等[42]建立了一种检测PEDVM基因、PDCoVM基因、TGEVN基因和PoRVVP6基因等11种病毒性腹泻病原的Luminex xTAG多重检测方法。现有的多重PCR方法只针对2个或3个靶向基因，不能适应高通量检测。然而，Luminex xTAG检测技术革新了在单一反应中同时检测和定量多个核酸的方法，这种方法甚至可以少量使用。由于该方法具有较高的特异性和敏感性，比常规多重PCR方法更敏感且更特异，已逐渐用于病原鉴定。

4 展 望

PoRV是目前引起仔猪腹泻较为普遍存在的病原之一，严重制约养猪业发展。近几年，随着PoRV鉴别诊断方法地推陈出新，病原学诊断方法存在方法单一和操作难度系数大，免疫学诊断方法成本高和效率低等问题，正逐渐被分子生物学诊断方法所替代。RT-PCR检测方法已经由单一RT-PCR向多重RT-PCR方向发展，并且多重RT-PCR和单一RT-PCR的检测结果基本一致；RT-qPCR检测方法已经克服传统PCR缺点，操作简便、特异性强且灵敏度高，但是由于探针等材料昂贵，所以检测成本高；RT-LAMP检测结果容易出现假阴性；二代测序技术具有高通量，但是测序时间长且成本高；ISH-RNA没有DNA原位杂交检测(ISH-DNA)效果好，因为RNA理化性质不稳定，空气中存在广谱性的RNA酶，在试验操作中RNA易被降解，所以ISH-RNA应用不广泛；Luminex xTAG特异性好且敏感度高，比常规PCR检测效果好，已经逐渐被广泛应用。目前由PoRV引起仔猪腹泻已经成为养猪业亟需解决的问题，但市面上仍缺少特效药及成熟的疫苗进行治疗与防控。开发更快捷更灵敏的检测技术，对掌握该病流行规律至关重要。