顶空-固相微萃取-气质联用法分析玫瑰醋挥发性风味物质及特征

张林祥，张蕾，秦子涵，陈嘉慧，邢利民，朱军莉*

1(浙江工商大学 食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江 杭州，310018) 2(湖州老恒和酿造有限公司，浙江 湖州，313213)

浙江玫瑰醋又称玫瑰米醋，是我国传统名醋中的液态发酵型食醋。浙江玫瑰醋以籼米为原料，在每年的4、5月份投料，经自然发花、冲缸放水、开耙通风、低温陈酿等过程制成，其酿造过程中微生物基本来自周边空气和草缸盖，并通过微生物的优胜劣汰以及环境的筛选，在达到微生物动态平衡的同时，不断使淀粉糖化、酒化、醋化，形成颇有特色的地方产品。玫瑰醋中含有大量有机酸、氨基酸以及微量矿物质等成分，色泽晶莹透澈，醇香可口。目前传统玫瑰醋的研究集中在其传统工艺的改进，如乙醇及醋酸发酵条件的优化[1-2]，而对其风味成分研究鲜有报道。

固相微萃取技术(solid-phase microextraction,SPME)结合GC或GC-MS被广泛应用于食醋挥发性成分检测。WANG等[3]采用SPME-GC-MS检测发现镇江香醋的主要风味物质为乙酸、乙酸乙酯、糠醛、苯乙醇、四甲基吡嗪、3-羟基丁酮和苯甲醛。ZHU等[4]利用SPME-GC-MS结合GC-O确定了丙酸、乙酸、丁酸、乙偶姻、3-甲基丁酸和糠醛是山西陈醋中主要特征性风味物质。挥发性成分也是玫瑰醋风味物质的重要组成，是评价玫瑰醋品质的重要指标，而关于玫瑰醋风味的研究较少，方冠宇[2]利用SPME-GC-MS对浙江玫瑰醋发酵过程中挥发性成分进行测定，将玫瑰醋样品分成发酵前期、发酵中期和发酵后期3大类，并得出不同发酵阶段特征性香气成分。

鉴于此，本研究分析6种不同产地来源的玫瑰醋理化品质，采用HS-SPME-GC-MS对传统玫瑰醋的挥发性风味物质进行检测，并利用气味活性值(odor activity value，OAV)结合正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)和变量投影重要性值(variable importance in projection，VIP)分析玫瑰醋样品中的特征风味物质，获得玫瑰醋关键差异香气成分，为提升玫瑰醋风味品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

6种玫瑰醋样品均为市售，产地及配料如表1所示；葡萄糖、CuSO4、NaCl、无水乙醇、NaOH、亚铁氰化钾、酒石酸钾钠、磷酸、盐酸，均为分析纯；β-苯乙醇、乙酸乙酯、苯甲醛、2-乙基丁酸、乙酸，均为国产色谱纯。

表1 玫瑰醋产地及配料信息Table 1 Origin and ingredient information of rosy vinegar

1.2 仪器与设备

7890A-5975C GC-MS联用仪，美国Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，美国Supelco公司；HH-6数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；酒精计，武强县华洋仪表厂；PHS-3C酸度计，上海雷磁仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 理化指标的测定

酸度：参照GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》；还原糖：参照GB 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》；氨基酸态氮：参照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》；色率：参照周利南等[5]的方法进行测定。

1.3.2 感官评价方法

感官分析采用定量描述性分析进行[6]。感官评价小组由8名经过培训的成员(4名男性和4名女性，23～30岁)组成。成员首先独立形成玫瑰醋香气描述词，随后进行组合讨论，确定玫瑰醋的8个感官描述属性(水果香、麸皮香、焦糖香、焦香、杏仁香、黄油香、烟味、酸味)。小组成员被要求在0～5的范围内记录每种属性的香气强度(0=不可感知，5=非常高的强度)。所有感官分析均在特定的感官品评室进行，每个样品随机编号重复测定3次，最终评分取平均值。

1.3.3 SPME-GC-MS检测方法

取醋样12.5 mL置于20 mL顶空瓶中，加入100 μL 2-乙基丁酸内标物，用带有硅橡胶隔垫的瓶盖密封。将顶空瓶放入50 ℃水浴锅平衡10 min，然后将已在240 ℃进样口老化至无杂峰的萃取头插入顶空瓶中距离液面1 cm处，50 ℃下吸附30 min，取出后插入GC进样口，240 ℃下解析2 min，进行GC-MS分析。

GC条件：色谱柱采用DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.5 μm)，进样口温度240 ℃，不分流进样，载气为氦气，恒流模式；柱流速1 mL/min；程序升温：柱温30 ℃保持6 min，以2 ℃/min升到140 ℃，然后以4 ℃/min升到220 ℃，保持10 min。

MS条件：电子电离源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z33～500。GC-MS测定结果通过NIST14数据库检索进行初步鉴定，再结合检测组分的保留时间、质谱等进行定性。以2-乙基丁酸为内标物，并配制混合标准溶液，采用加标法测定各组分的相对校正因子fi，相对校正因子(fi)按公式(1)计算[2]：

(1)

式中：ΔWi和ΔAi分别为组分标准品i的增加质量浓度(μg/L)和对应增加峰面积；Ws和As为内标物s的质量浓度(μg/L)与峰面积。

待测风味物质的含量按公式(2)计算：

(2)

式中：Wi和Ai分别为被测组分的质量浓度(μg/L)与峰面积；Ws和As分别为内标物的质量浓度(μg/L)与峰面积。

1.4 关键风味物质分析

对各种挥发性化合物定量后，按公式(3)计算挥发性成分OAV：

OAVi=Ci/Ti

(3)

式中：Ci，化合物i的质量浓度，μg/L；Ti，化合物i气味阈值，μg/L，化合物气味阈值来源于文献[7～9]。通常认为OAV>1时，该化合物对总体香气可能有贡献价值。

1.5 数据分析

采用Origin 8.5和Excel对实验数据进行处理、分析以及图形绘制；采用SPSS 20.0进行差异显著性的分析，以P<0.05为差异显著；采用SIMCA-P进行PLS-DA和VIP值分析。

2 结果与分析

2.1 玫瑰醋理化指标分析

6种玫瑰醋样品的理化性质如表2所示。玫瑰醋的还原糖含量为1.30～6.14 g/100 mL，其中以M5玫瑰醋含量最高，可能与后期调配添加的蔗糖相关。还原糖是细菌分解淀粉及低聚糖产生的产物，适量的还原糖可以丰富醋柔和的口感[10]。玫瑰醋样品pH值为2.73～3.07，总酸含量在3.40～4.41 g/100 mL之间，两者存在一定的相关性，总酸含量高的玫瑰醋样品pH值低，这与之前的研究一致[10]。玫瑰醋的pH值低于陈醋，其中山西和镇江陈醋pH值分别为3.67～3.88和3.35～3.97[11]，主要原因可能是原料、发酵微生物和储存时间的差异。

6种玫瑰醋的氨基酸态氮含量为0.082～0.109 g/100 mL，其中M5样品玫瑰醋略低于其他组。氨基酸态氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，该指标越高，表明玫瑰醋鲜味越好[12]。玫瑰醋以其色泽鲜艳的玫瑰红色而闻名，采用色率对玫瑰醋色泽进行量化评价，色率数值越大表示玫瑰醋颜色越深。6组玫瑰醋中M1样品为暗红色，而其他5组玫瑰醋色率相近，为透亮的玫瑰红色，不同来源玫瑰醋颜色差异可能与陈酿时间、发酵原料有关[13]。

表2 玫瑰醋理化指标分析结果Table 2 Analysis results of physical and chemical indexes of rosy vinegar

2.2 玫瑰醋感官评价

采用感官定量描述分析比较6种不同产地玫瑰醋样品香气，筛选出了8个描述玫瑰醋风味的词汇，即果香、麸皮香、焦香、焦糖香、烟味、黄油香、杏仁香、酸味，并考察玫瑰醋综合复杂性，如图1所示。M2、M3、M4三种玫瑰醋具有更强的水果味和黄油味，而M1、M5、M6玫瑰醋样品表现出更强的麸皮香气以及烟味。从香气层面来看，各玫瑰醋香气特征存在明显的差异，可能与原料、发酵和陈酿工艺的差别有关。6种玫瑰醋中水果香、麸皮香、焦糖香气及综合复杂性的香气特征都具有显著性差异，其中麸皮香差异最大。福建红曲米醋更具备甜味、涩味、甜香、果香、麸皮香、花香和酒香味，山西老陈醋则表现出甜香、烘烤香、坚果香、酸香、花果香和奶香[14]。

图1 玫瑰醋感官评价分析Fig.1 Sensory evaluation of rosy vinegar注：*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001

2.3 玫瑰醋香气成分分析

为评价6种玫瑰醋香气差异，采用HS-SPME-GC-MS分析鉴定玫瑰醋样品的挥发性化合物成分及含量，结果如图2和表3所示。6种玫瑰醋样品中共检测出56种化合物，包括7种醇类物质、7种醛类物质、9种酸类物质、15种酯类物质、5种酮类物质、2种酚类物质以及11种杂环类物质。6组玫瑰醋挥发性成分各组分含量占比存在一定差异，其中酯类、酸类和醛酮类在玫瑰醋的所有香气化合物中占比较高。M2挥发性化合物含量最高，为6 389.26 μg/L，其他3种杭嘉湖产玫瑰醋挥发性成分含量相近，而非杭嘉湖产2种玫瑰醋挥发性成分含量较低。

图2 玫瑰醋挥发性成分种类含量Fig.2 The content of volatile components in rosy vinegar

酸类物质是食醋最重要的成分之一，占玫瑰醋香气总量的44.60%～62.71%，赋予玫瑰醋特定的风味及感官属性。6种玫瑰醋中酸类物质含量差别不大，乙酸是含量最高的物质，为2 263.70～3 077.65 μg/L，其与发酵中糠醛的生成以及酯化反应相关。6组玫瑰醋样品中均检测出丙酸，可能是微生物通过特殊的发酵工艺条件或者利用某些特定的原料作用产生，在四川麸醋及山西老陈醋中也有检出[15]，为玫瑰醋提供油脂奶酪香气。

表3 玫瑰醋挥发性成分含量 单位：μg/L

注:-表示未检出；同行标有不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)(下同)

酯类化合物占香气总量的16.32%～24.01%，是玫瑰醋中定性定量的风味化合物最丰富的类别之一，主要产生于酒精和醋酸发酵阶段。乙酸乙酯是除乙酸外玫瑰醋中含量最高的香气化合物，赋予玫瑰醋水果香及花香[16]。异丁酸乙酯、异戊酸乙酯在6种玫瑰醋中均有检出，含量较低，但具有较低的阈值，是玫瑰醋香气重要的组成部分。

醛类化合物主要来源于脂氧化和降解，玫瑰醋中醛类物质含量较高，占香气含量的10.88%～22.24%。玫瑰醋中主要的醛类化合物有糠醛、苯乙醛、苯甲醛、异戊醛以及3-甲基丁醛，其中糠醛是在陈酿过程中通过氨基酸脱氨、脱羧形成，具有焦糖气息，其含量与陈酿时间相关[16]。苯甲醛、苯乙醛和3-甲基丁醛的形成与氨基酸的代谢密切相关。苯甲醛是一种芳香醛，具有糖果、甜味和杏仁气味[17]。ZHU等[4]发现在山西老陈醋酿造过程中乳酸菌参与苯甲醛的形成。苯乙醛是另一种芳香醛，具有强烈的甜香和巧克力的香味，可能与苯乙醇氧化或苯丙基氨基酸降解有关[15]。

醇类化合物在玫瑰醋中占香气总量的2.55%～8.19%，大多数由微生物分解糖苷类、氨基酸和脂肪酸产生，主要产生于酒精发酵阶段[18]。玫瑰醋中醇类化合物含量第2的是苯乙醇，含量为62.05～142.94 μg/L，主要来源于酵母菌的氨基酸代谢产物[19]。而异戊醇和2,3-丁二醇分别增加玫瑰醋水果和奶油香气，醇类物质组成可能与酿造过程微生物的多样性及高温和酯化反应相关[4]。

酮类以3-羟基-2-丁酮(又叫乙偶姻)为主要挥发性成分，该物质具有牛奶香气，且合成途径较多，可通过2,3-丁二醇氧化生成，也可由丙酮酸转化或经过糖酵解生成[20]。除此之外，2,3-丁二酮也是玫瑰醋中含量较高的酮类物质，3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二酮是山西陈醋中的关键风味物质，也是关键风味化合物吡嗪的前体[21]。

杂环及酚类物质在玫瑰醋中含量较少(<1%)，形成过程较复杂，主要由酿造原料带入。在M1、M2、M4玫瑰醋样品中检测出2,3,5,6-四甲基吡嗪即川芎嗪，在M2样品中含量最高，达到342.59 μg/L，该物质具有很好的药理作用，具有抗血栓、抑制癫痫、抗肿瘤的作用[22]。

2.4 玫瑰醋挥发性成分OAV分析

风味物质对玫瑰醋整体风味的贡献可结合化合物的阈值进行评价，风味物质的阈值不同，对整体风味贡献也有差异[23]。结合表3化合物的定性定量结果及文献中对应化合物在水中的阈值，计算得到OAV(表4)。在6种玫瑰醋样品中，共计算得到7种OAV>1风味物质，分别为异戊醛、苯甲醛、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、3-乙酰基-2-丁酮、2,3-丁二酮、2-乙酰基呋喃。醇类及酸类化合物在玫瑰醋中含量较高但一般具有较高的气味阈值，对玫瑰醋风味贡献较小，而部分低浓度的化合物例如3-乙酰基-2-丁酮、2,3-丁二酮、2-乙酰基呋喃等酮类或杂环类物质会对玫瑰醋风味造成比较大的影响。

表4 玫瑰醋挥发性成分的阈值、气味描述及气味活性值Table 4 Threshold, odor description and OAV of volatile components in rosy vinegar

玫瑰醋样品中7种香气化合物的OAV不同，总体来说，玫瑰醋香气主要以水果香、奶油香和黄油香为主，这与M2、M3、M4在感官上呈现甜香相符，而在所有样品中乙酸乙酯、3-乙酰基-2-丁酮和2,3-丁二酮OAV均远高于其他香气化合物，可认为乙酸乙酯、3-乙酰基-2-丁酮和2,3-丁二酮可能是浙江玫瑰醋特征风味香气成分。

2.5 玫瑰醋挥发性成分OPLS-DA及VIP分析

OPLS-DA是在PCA基础上再进行计算分析的一种数据可视化分析方法，同时具备降维和监督模式，可通过预设分类，有效去除未控制变量对最终数据造成的影响，进一步挖掘数据之间相关性，同时可以量化特征风味物质造成样品之间差异的程度[24]。将玫瑰醋OAV>1的风味物质含量作为Y变量进行OPLS-DA建模分析。由图3可知，模型中R2X=0.830，Q2=0.616，其中R2X=0.830表明该模型能反映83.0%数据的变化，R2和Q2高于0.5(50%)显示该模型具有较高的可解释度和拟合度。图3显示6种玫瑰醋样品在OPLS-DA得分散点图中组内聚集性较好，组间有一定程度的分离。M1、M4、M5聚为一类，表明这3种样品中香气化合物对整体玫瑰醋香气贡献相似，而M2单独聚类，提示M2玫瑰醋样品的风味化合物对香气总体贡献不同于其他5种样品，可能与M2的风味物质较多有关。

图3 玫瑰醋风味物质的 OPLS-DA 分数散点图Fig.3 Scores plot of OPLS-DA model of rosy vinegar flavor compounds

利用OPLS-DA形成的VIP值的大小进行关键变量分析，一般来说，VIP值越大的变量对模型贡献率越大。以VIP值>1为界限得到异戊醛、乙酸乙酯和乙酸异戊酯(图4)是6种玫瑰醋中差异贡献最大的代谢物，其中乙酸乙酯也是四川保宁醋和山西老陈醋之间的主要差异代谢物，与合成前体物质乙酸的含量直接相关[24]。乙酸异戊酯同样是镇江香醋中重要的酯类物质，含量受微生物和环境的影响，异戊醛是玫瑰醋关键呈香化合物，来源于发酵过程脂类物质氧化和降解[9]。

图4 基于OPLS-DA模型分析的VIP预测值分布图Fig.4 Distribution of VIP forecast values based on OPLS-DA model analysis

3 结论

本研究分析和比较了6个产地玫瑰醋的理化特性和挥发性风味物质。结果表明，6种玫瑰醋样品的pH、总酸及氨基酸态氮无显著差异，仅因工艺不同还原糖含量存在显著性差异。玫瑰醋具有水果香、麸皮香、焦糖香气及香气复杂性等感官属性，且产地间感官特性存在显著性差异，特别是麸皮香值。6种玫瑰醋样品中共鉴定出7类物质76种风味成分，其中浙江产玫瑰醋挥发性成分总量高于镇江产地。玫瑰醋含较丰富的挥发性风味成分，包括苯乙醇、糠醛、苯甲醛、乙酸乙酯、乙酸、异戊酸、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯、2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮等物质。玫瑰醋样品中OAV值>1的有7种成分，其中乙酸乙酯、3-乙酰基-2-丁酮和2,3-丁二酮被认为是浙江玫瑰醋特征风味香气成分。PLS-DA结合VIP值判断异戊醛、乙酸乙酯、乙酸异戊酯是玫瑰醋样品风味差异的主要风味物质。